微生物培養基質控與圖解——培養基的高壓滅菌及效果驗證

第三節  培養基的高壓滅菌及效果驗證

 

    消毒滅菌在醫學實踐上有著重要意義。它可切斷傳播途徑、控製感染擴散造成的危害；也可殺滅物品或器皿上的細菌，防止醫院感染；在醫學微生物檢驗的領域中，消毒滅菌是保正感染的病原學檢驗不受外來微生物汙染的前提。

    （一）術語

    消毒( disinfection)、火菌(sterilization)、抑菌(bacteriostasis)、防腐（antisepsis）和無菌( asepsis)是常用術語。下麵就術語概念加以敘述。

    (1)滅菌。是用適當的物理或化學手段將物品中活的微生物殺滅或除去的方法。本法適用於製劑、原料、輔料及醫療器械等物品的滅菌。（如外科器械、注射器、基礎培養基滅菌等。）

    (2)消毒。是破壞物體上活的病原微生物的方法，但不包括細菌芽胞和非病原微生物。如用酒精溶液浸泡體溫計、新潔爾滅液擦拭檢查台等。用於消毒的化學物品稱消毒劑( dis-infectant)。一般而言，消毒對象是指物體而不是機體。

    (3)防腐。直接使用防腐劑(antiseptics)破壞或抑製活的病原微牛物的方法。如外科手術前碘液擦洗皮膚、雙氧水清創傷口或殺菌肥皂清冼雙手等。

    (4)無菌。防止感染病原體進入滅菌組織或物品的操作技術稱無菌操作。無菌即為不存在活的微生物。

    用於消毒滅菌的物理方法有熱力、電離輻射、超聲波、過濾等。這裏介紹熱力消毒滅菌法。高熱破壞微生物蛋白質、核酸、細胞壁和細胞膜，從而導致微生物死亡。受高熱作用後，蛋白質分子運動加快，肽鏈連接鍵斷裂，蛋白變性凝固；細胞膜功能受損使胞內物質漏出，細菌內外環境平衡失調。

    不同種類微生物對熱的耐受力不同，多數無芽胞細菌經55-60℃作用30-60分鍾後死亡，100℃時迅速死亡。有芽胞細菌則對高溫有強的抵抗力，如肉毒芽胞梭菌煮沸需3—5小時才死亡。

    熱力滅菌分幹熱滅菌法和濕熱滅菌法兩大類，相同溫度下後者較前告效力大，其原因

是：①濕熱環境中菌體蛋白易凝固；②濕熱穿透力比幹熱大；③濕熱蒸氣變為液態時可釋放潛熱，迅速提高被滅菌物體的溫度。

    1．幹熱（dry heat）滅菌法

(1)焚燒。直接點燃或在焚燒爐內進行，僅適用於廢棄物品或動物屍體。

(2)燒灼。直接以火焰滅菌，適用於微生物學實驗室接種環、針和試管口等滅菌。

    (3)幹烤。在幹烤箱內進行，加熱至150-180℃ 2-4小時達到滅菌效果，適用於高溫下不變質、不被破壞和不蒸發的物品，如玻璃器皿、瓷器，不能用於塑料、棉、紙製品。

    2．濕熱( moist heat)消毒滅菌法

    (1)巴氏消毒法。巴氏消毒法(pasteurization)是用較低溫度殺滅液體中的病原微生物或特定微生物而保持物品中所需的不耐熱成分的方法。此法由巴斯德創立，用於酒類消毒而得名。目前用於牛乳消毒。方法有兩種：一種為71.6℃加熱15秒，另一種為63-66℃加熱30分鍾。大多采用第一種方法。

    (2)煮沸法。在1個大氣壓下，水煮沸後溫度達100℃，煮沸5分鍾後可殺死一般細菌繁殖體。如於水中加入2%碳酸鈉，可將其沸點提高至105℃，既可促進芽胞的殺滅，又可防止金屬器皿生鏽。

    (3)流通蒸氣消毒法。又稱常壓蒸氣消毒法，常用附諾(Amold)流通蒸氣滅菌器，利用1個大氣壓下100℃水蒸氣進行消毒，10-30分鍾後細菌繁殖體被殺死，但對芽孢作用不大。

    (4)間歇滅菌法（fractional sterilization）。采用間歇方式達到滅菌目的。將滅菌物品置於阿諾流通蒸氣滅菌器內，100℃加熱15-30分鍾，每日1次，連續3次。每次滅菌後取出物品置37℃孵育箱過夜，致殘存的芽胞發育成繁殖體，次日再通過流通蒸氣滅菌器加熱而被殺滅。如此反複，既可殺滅芽胞，又可使不耐高溫的物質免受影響。若某些物質不耐100攝氏度，則可將溫度下降至75-80℃，每次加熱時間延長到30-60分鍾，常用血清凝固器對呂氏血清培養基和L-J培養基的滅菌屬此方法。

    (5)高壓蒸氣火菌法。利用密閉的耐高壓蒸氣滅菌器(autoclave)，在蒸氣不外溢的條件下，使鍋內壓力增高，隨之蒸氣溫度也增高。通常在103.4kPa壓力下蒸氣溫度達到121.3℃，維持15-20分鍾，可殺滅所有的繁殖體和芽胞。本法適用於耐高溫、耐濕物品的滅菌，如普通培養基、生理鹽水、手術敷料等。

    （二）下向主要介紹高壓蒸氣滅菌器滅菌效果的驗證方法

    高壓蒸氣滅菌器使物品滅菌後達到無菌要求，這是藥品實驗中的基本保證。高壓滅菌器滅菌效果是否合格足實驗成敗的最基礎最關鍵的首要步驟。除少數培養基隻需加熱溶解，不需高壓滅菌外，大部分培養基均需121℃高壓滅菌15-30分鍾。尤其是對無菌試驗培養基滅菌不徹底，直接關係到對藥品的無菌試驗結果。因此必須認真對高壓滅菌器進行滅菌效果的驗證。為此我們提供了進行滅菌效果驗證的一個簡易可行的方法。

    1．試驗材料

(1)嗜熱脂肪芽胞杆菌紙片。嗜熱脂肪芽胞杆菌(Bacillus  stearothermophilus)

ATCC7053是本法常用的生物指示菌，含芽胞量5-lO⁵ CFU/片。

    (2) 121℃壓力蒸氣滅菌化學指示卡。

    (3)溴甲酚紫腖水培養基116℃高壓滅菌20分鍾後備用。

    (4)O—150℃留點溫度計。

    2．方法與結果

    將嗜熱脂肪芽胞杆菌紙片（以下簡稱菌片）用無菌鑷子放人密封試管中。化學指示卡和留點溫度計放入敞口試管中。以上兩種試管各準備5-10份。分別放置在高壓滅菌器蒸氣口處、底部排氣口處及底部出水口處或上下左右中間5處。如滅菌器為二層，則需放10處。

    留點溫度計標化合格後方可用於驗證試驗。檢測前，需將溫度計的水銀柱甩至40℃以下。每次監測後留點溫度計的溫差應存l℃之間，則說明滅菌器內的溫度分布是均勻的。

    滅菌後的菌片應在嚴格無菌操作條件下放入滅菌後的溴甲酚紫腖水培養基內56-60℃培養24-48小時，觀察顏色變化。如培養基變為黃色，說明菌片中的嗜熱脂肪芽胞杆菌尚未完全滅活，細菌仍可在培養基中生長，分解葡萄糖產酸變為黃色。如培養基顏色不變化仍為紫色，則說明芽胞已滅活。同時要用未經滅菌的紙片放入培養基內作為陽性對照，不加紙片的空白培養基作為陰性對照。

    化學指示卡上的指示色塊，在高壓蒸氣滅菌時，由淡黃色變為黑色。隨著顏色變化的深淺，並與對照色相比，可判斷滅菌效果是否達到要求。化學指示卡應在幹燥處保存。遇潮會變色，影響滅菌效果的觀測。

    高壓蒸氣滅菌必須使蒸氣順利進入滅菌器內，與滅菌物品接觸，並將原有的冷空氣排出方可達到滅菌的效果。要進行空載熱分布和滿載熱穿透力驗證(滿載時不超過總體積的2/3)。二種驗證各重複三次，共做六次。

    5個點六次試驗表明溫度均在121℃，化學指示卡變黑；程度與對照色一致；培養基均未改變顏色，說明高壓蒸氣滅菌效果合格。

    高壓滅菌器屬於強檢儀器，但強檢隻是對儀器物理參數的考核。所以做過強檢的滅菌器還必須進行滅菌效果的驗證。一些單位常常忽略了這個重要的問題。國內市售的手提滅菌器，往往儀器指針達到所需的溫度，但滅菌物品的實際溫度卻未達到要求。導致滅菌物品不徹底，影響實驗結果。培養基滅菌不徹底，影響培養基的使用及結果判斷。因此高壓蒸氣滅菌器無菌效果的驗證是一個必須引起重視的問題。

（三）滅菌時的注意事項

    使用高壓蒸氣滅菌器時，首先應注意在開放蒸氣的同時，排除滅菌器內的冷空氣。必須將器內冷空氣全部排除後，才可關閉排氣孔。假如滅菌器內仍存留有部分空氣時，剛壓力表上雖已達到了某一壓力值，但器內之溫度仍未達到相應之度數。存留的空氣越多，剛二者相差也越大。差也越大，器內溫度不足，滅菌則不徹底。

表蒸汽壓力與溫度的關係

 

 

表 高壓蒸汽滅菌器中溫度與冷空氣排出量的關係