反硝化細菌的篩選及培養條件的研究

微生物在自然界氮素循環中起著重要作用，如固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用( denitrification ) 。其中，硝化作用與反硝化作用維持自然界氨的平衡及氮的正常循環。 氨化作用由氨化細菌或真菌的作用將 有機氮分解成為氨與氨化合物， 硝化作用由亞硝酸鹽 細菌和硝酸鹽細菌將氨化合物氧化為亞硝酸鹽和硝 酸鹽；反硝化作用也稱脫氮作用，由微生物在厭氧或 微厭氧條件下將硝酸鹽還原成氧化亞氮或氮氣。反硝化作用對於控製水體富營養化，處理汙水和淨化水域有著極大的利用價值。目前已發現某些植物、真菌和細菌都具有反硝化作用。已知有50以上的微生物 能夠進行反硝化作用 ，其中絕大多數是細菌。 

 

反硝化細菌 ( denitrifying  bacteria )通過誘導產生硝酸還原酶和亞硝酸還原酶對硝酸鹽和亞硝酸鹽進行還原。不同反硝化細菌的反硝化作用能力不同，生長條件也存在很大差異。作者從玉溪紅塔集團技術中心生理生化實驗室篩選出的45株具有反硝化作用的細菌菌株中， 進一步篩選具有較強反硝化作用能力的菌株，並對目的菌株的最適培養基、生長溫度及好氣性進行測定 ，為反硝化細菌的利用提供依據。 

l 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及來源

反硝化細菌菌株： B11 ， B15 ， B20 ， B27 ， B28 ， B67 ，B88，B112，B115，B118，B121，B132，B135，B223，B224，B226，B237，B241，B246，B248，B249，B260，B289，B290，B291，B292，B294，B295，B296，B297，B298，B299，B300，B310，B311，B315，B316，B318，B319 ， B320 ， B322 ， B323 ， B329 ， B330 ， B419 。由玉溪紅塔集團技術中心生理生化實驗室提供。 

1.1.2培養基及製備

1.1.2.1斜麵培養基

牛肉浸膏蛋白腖培養基。 

1.1.2.2  Giltay培養基

A溶液 ： KNO₃ 1.0g ，天冬酰胺1.0 g ，1％BTB酒精溶液5 mL ，蒸餾水500 mL 。

B溶液： 檸檬酸鈉8.5 g ，MgSO₄· 7 H ₂O 1.0g ， F e Cl₃·6 H ₂ O 0.05g ， KH ₂ PO₄  1.0g ， CaC1₂· 2 H ₂O 0.2g ， 蒸餾水500 mL 。

混合A、 B兩溶液調節 p H值為7.0～ 7.2 ， 分別裝入 250 mL三角瓶，每瓶150 mL， 滅菌備用。 

1.1.2.3待篩培養基

硝酸鹽培養基：牛肉浸膏3g ，蛋白腖5 g ，KNO₃ ( NaNO₃ ) 1 g ， 蒸餾水1000m L 。 

反硝化細菌培養基：KNO₃2 g ， MgSO₄·7 H₂O 0.2 g ，K₂HPO₄  0.5 g ，酒石酸鉀鈉20g ，蒸餾水1000 mL 。 

Y B培養基。

調節待篩培養基和YB培養基pH為7.2 ，分別裝入250 mL三角瓶， 每瓶150 mL， 滅菌備用。 

1.1.3儀器與器材

自動化學分析儀， CO₂ 培養箱，血球計數板，搖床。 

1.2方法

1.2.1菌株反硝化作用能力的測定

1.2.1.1產氣特性測定

參考Giltay方法測定反硝化作用菌株的產氣特性 ： 

將製備的 Giltay液體培養基，加入大試管 ( 20mm×200 mm)中，把纏有細線的小試管 ( 12 mm×75mm ) 倒立放入大試管中，將小試管中的氣體排淨，塞住大試管，留部分細線在大試管外，便於小試管的提升和降落，滅菌備用。

用 Giltay液體培養基2 mL洗下活化後的菌株， 轉入盛有小試管和 Gi l t a y液體培養基的大試管中，將小試管提升一段距離，以便接收氣體，接種時注意不要使小試管內進入氣體。每個菌株接4支試管，3 0℃ 恒溫培養 1 0～1 4 d ， 觀察結果。重複 3次。 

1.2.1.2硝酸鹽降解能力的測定

將產氣試管內的培養基濾紙過濾，取濾液，用蒸餾水稀釋100倍 ，以自動化學分析儀檢測培養基中的含氮量，測定菌株的反硝化作用能力，重複3次。 以滅菌後的培養基作為對照。 

1.2.2菌株適宜培養基及好氣性測定

將篩選出的菌株在斜麵上3 0℃培養1 d後，用10m L無菌水洗下，振蕩混勻。分別轉接1mL洗下的菌液於滅菌的硝酸鹽培養基、反硝化細菌選培養基和 YB培養基中。每個處理都分別在搖床和CO₂培養箱( CO₂濃度為20％) 中，30℃振蕩培養1d。稀釋平板法測定篩選菌株的最適培養基及好氣性。重複 3次。 

1.2.3生長溫度的測定

設20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等 5種溫度梯度，30℃YB培養基培養1 d ，稀釋平板法測定菌株生長的最適溫度。 

1.2.4菌體濃度的測定

設18、21、24、27、30、33 h等7個時間梯度，30℃YB培養基培養，用血球計數法測定所篩菌株在最適 生長條件下菌體的最高濃度。 

2 結果與分析

2.1菌株反硝化作用強度的篩選

2.1.1產氣測定

在接種B88、B237菌株的試管內，2d後培養基開始變藍，並有少量氣體產生，滯留在小試管中；3d後培養基由綠色變為藍色，小試管內的氣體明顯增多；接種3～4 d後，產氣的速度最快，氣體量最多，以後幾天則看不出氣體量的增加。接種其他菌株的試管內，培養基顏色由上向下逐漸變藍 ，但不產氣。

利用Giltay培養基法篩選菌株，試管中的培養基由於反硝化細菌硝酸還原酶的作用 ， 硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，使培養基呈堿性，培養基顏色由綠色變為藍色。反硝化作用較強的菌株通過亞硝酸還原酶的作用，亞硝酸鹽進一步還原成氧化亞氮或氮氣， 滯留在小試管中。在45個供試菌株中， B88和 B237菌株能夠較好地降解培養基中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，產氣早，速度快，3～4 d產氣達到高峰，表明其反硝化作用較強。其他菌株雖然也都能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，但不能進一步還原亞硝酸鹽，反硝化作用較弱。

2.1.2菌株降解硝酸鹽特性的測定在接種B88 、B237的培養基中，含氮量明顯降低，表明 B88 、 B237菌株具有較強的反硝化作用，能夠有效降解培養基中的硝酸鹽 ，見表 1 。 

表 1 菌株反硝化作用效果測定( r=0.99921 ， 100 m g·L^-1  ) 

2.2培養基及好氣性測定

由於反硝化細菌是在厭氧或微厭氧的條件下通過硝酸鹽誘導產生的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶進行反硝化作用，因此，大多數研究人員在實驗室培養反硝化細菌時，多在微厭氧條件下進行。但本試驗結果表明，不管有無硝酸鹽的誘導，B88、B237菌株的快速生長是好氣性的，生長受氧氣供應量的限製，CO₂含量 (20％)的提高，對菌株的生長具有較強抑製作用； 在不同培養基上，其生長速度差別較大；在反硝化細菌培養基上生長速度反而慢 ， 而在 Y B培養基中的 生長速度快，表2 、表 3 。 

表 2 在恒溫箱、 CO₂培養箱內不同培養基對B 8 8菌株生長的影響

 

表 2 在恒溫箱、 CO₂培養箱內不同培養基對B237菌株生長的影響

 

2 ． 3生長溫度測定

溫度對B88、B237菌株的生長速度有顯著影響， 在好氣條件下，用YB培養基振蕩培養，菌株在20℃～40℃之間均能較好地生長，3 0℃左右為最適生長溫度。 

2.4生長濃度的測定

反硝化細菌經過緩慢增長期和指數增長期後，由於營養的消耗和細菌之間的抑製作用， 菌體衰老、 消解，細菌濃度逐漸降低。B88菌株在最適培養條件下最高生長濃度為6.1×1 0   個·mL^-1，B237菌株在最適培養條件下最高生長濃度為1.54×10⁸個· mL^-1  。 

3 結論與討論

反硝化細菌主要應用於工業廢水或汙染河流、池塘的水處理，降低水中的有害含氮物質， 改善水質。反硝化細菌的培養，一般采用專用的反硝化細菌培養基。但不同的反硝化細菌好氣性不同、並且不同碳源、pH值、溫度、培養基成分對反硝化細菌的生長有很大影響。在常用的反硝化細菌培養基中，篩選最適生長的培養基，對於細菌的富集培養及工業應用具有重 要意義。 

常規 Giltay培養基法篩選反硝化細菌使用規格為15 mm×150 mm的試管和杜哈姆管，這樣滯留在杜哈姆管的氣體量少，也不容易收集。本試驗用20 mm×200 mm的大試管，用 12 mm×75 m m的小試管代替杜哈姆管，並將小試管用細線纏繞懸掛，有利於滯留更多的氣體，並且容易收集，也更有利於對氣體成分進行檢測。采用常規方法，從4 5株反硝化細菌中篩選出 B88 、 B237兩株反硝化作用較強的菌株，從幾種常用的反硝化細菌培養基中篩選出適合菌株生長的 YB 培養基，並確定菌株最適生長溫度為3 0℃ ，以及菌株在Y B培養基中生長的最高濃度：B 8 8為6.1 ×10⁸個·mL^-1  ； B237為 1.54×10⁸ 個 · mL^-1 。

 B88 、B237菌株的鑒定及其在工業上應用有待於進一步研究。