【摘要】 目的研究淡竹葉清熱作用有效部位及化學成分，為淡竹葉的進一步開發利用和質量標準的製定提供科學依據。方法采用體外抑菌實驗篩選淡竹葉有效抑菌部位，並采用HPLC-MS法分析抑菌部位的化學成分。結果淡竹葉甲醇提取部位具有抑菌作用，根據液質聯用圖譜及文獻，分析鑒定出淡竹葉甲醇提取部位中6個化學成分，分別為香草酸、香豆酸、牡荊苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黃酮、蘆竹素或其同分異構體白茅素及苜蓿素。結論淡竹葉甲醇提取部位具有一定的抗菌活性，對各菌種的抑菌效果有較大差異，這一部位可能與淡竹葉清熱解毒功效相關。采用HPLC-MS法分析鑒定有效部位化學成分，保留了液相色譜與質譜兼具的微量、快速的優點,結合了前者的高分離效能與後者的準確性及選擇性的特點,方法穩定可靠，為淡竹葉的進一步開發利用和質量標準的完善提供科學依據。
【關鍵詞】 中藥鑒定 淡竹葉 抑菌實驗 液質聯用
Abstract：ObjectiveTo investigate the effective part and components of Heat-cleaning in Herb Lophatheri,and to provide scientific accord for further development and establishment of quality specification of Herb Lophatheri.MethodsScreen effective antiblastic part by bacteriostasis experiment in vitro,and analyze the chemical compositions with HPLC-MS in this part.ResultsThe part extracted with MeOH was effective bacteriostasis,6 components were detected by HPLC-MS atlas and relative articles in it.They were vanillic acid,coumaric acid,vitexin,Tricin7-β-D-glucosyloxy-flavone,arundoin,and Tricin.ConclusionThe part extracted with MeOH has antibacterial activity,and the activities are different to different bacterium,this part may be correlated with heat-cleaning and detoxicating in herb Lophatheri. HPLC-MS has good quality of both HPLC and MS,it is stable and reliability, and can provide sciencic proif for further development and improvement of quality specification of herb Lophatheri.
Key words：Authentication of Chinese medicines; Herb lophatheri; Bacteriostasis experiment; HPLC/MS/MS
淡竹葉為禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracile Brongn. 的幹燥莖葉［1］。始載於《本草綱目》，1977年以來的曆版《中國藥典》均有收載，具有清熱除煩、利尿的功效。用於熱病煩渴，小便赤澀、淋痛，口舌生瘡。淡竹葉為衛生部公布的藥食兩用中藥之一，近年來多有製成保健涼茶［2］、淡竹葉酸奶［3］等。
淡竹葉的有效成分物質基礎研究一直較為薄弱，現有化學成分的研究顯示淡竹葉主含黃酮、三萜類、多糖、酚性成分、氨基酸、有機酸及多種微量元素等［4～6］。依據現代醫學理論，結合淡竹葉的中醫臨床功效，本實驗對淡竹葉不同溶劑的提取部位進行了抑菌活性的研究，對淡竹葉清熱有效物質基礎進行初步篩選，並運用液質聯用分析手段對所篩選的部位進行化學成分分析，為淡竹葉的進一步開發利用和質量標準的製定提供科學依據。
1 儀器與材料
1.1 儀器手提式壓力蒸氣滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）；移液槍（北京金花移液器廠）；HPLC－MS/MS液質聯用儀（Water’s公司，型號Quattro Primer，產地：美國）。
1.2 菌株
大腸杆菌 CMCC(B) 44103；金葡菌CMCC(B)26003；乙鏈菌CMCC（B）32210；綠膿菌CMCC(B)24430。
1.3 藥物營養瓊脂（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20040304）；肉湯培養基（國藥集團化學試劑有限公司，批號20060310）；血瓊脂基礎（國藥集團化學試劑有限公司，批號20060228）；葡萄糖肉湯（國藥集團化學試劑有限公司，批號10010518）；香草酸對照品（中國藥品生物製品檢定所，批號110776－200402）。牡荊苷對照品（中國藥品生物製品檢定所，批號11876－200501）。淡竹葉采於江蘇省寶華山，經南京中醫藥大學鑒定教研室吳啟南教授鑒定為禾本科(Gramineae)植物淡竹葉Lophatherum gracile Brongn.的幹燥莖葉。
2 方法與結果
2.1 不同提取部位抑菌實驗
2.1.1 提取部位製備
淡竹葉置於多功能提取罐，60％乙醇回流提取5 h，提取液減壓回收溶劑得到淡竹葉總浸膏，總浸膏與矽藻土拌勻，分別加入石油醚、二氯甲烷、甲醇、水逐級超聲提取，減壓回收溶劑，得石油醚提取部位、二氯甲烷提取部位、甲醇提取部位和水提取部位，作為供試品。
2.1.2 不同提取部位抑菌實驗取上述供試品各1 g，加入蒸餾水1 ml，超聲溶解。在超淨工作台上將滅菌後的培養基倒入無菌培養皿中，待冷卻凝固後，用無菌移液管吸取1∶1 000稀釋的大腸、金葡、綠膿菌液加到平皿上，用刮鏟將菌液塗勻，再用打孔器在培養基上打孔，打孔後每個孔內注入25 μl藥液，37℃培養24 h，觀察實驗結果。結果見表1。表1 淡竹葉不同提取部位抑菌實驗結果（略）
從藥敏實驗中發現，淡竹葉的石油醚、二氯甲烷及水提取部位對該3種細菌抑菌效果為陰性，甲醇提取部位對該3種細菌抑菌效果為陽性，故對甲醇提取部位的抑菌效果做進一步的實驗。
2.2 甲醇提取部位抑菌實驗
2.2.1 對金葡菌、大腸杆菌、綠膿杆菌的抑菌實驗將甲醇提取部位的浸膏配成相當於生藥濃度為40，20，10，5，2.5，1.25，0.625 g•ml-1。同“2.1”項下方法實驗，製作培養基，將菌液塗勻於培養基上，打孔，分別注入20 μl的藥液，37℃培養，24 h後觀察抑菌結果。結果見表2。表2 不同濃度甲醇提取部位對3菌種抑菌圈直徑平均值（略）
從表2中我們可以看出淡竹葉甲醇提取部位對金葡菌、綠膿杆菌和大腸杆菌均有一定的抑菌效果，抑菌效果依次為：綠膿杆菌>金葡菌>大腸杆菌，但都屬於低敏的範圍。
2.2.2 甲醇提取部位對乙鏈球菌的抑菌實驗將提取部位按照濃度為10，5，2.5，1.25，0.625 g•ml-1製作血平板，加入乙鏈球菌，放入37℃溫箱培養24 h，次日觀察實驗結果。
結果顯示，5 g•ml-1以下均有乙鏈球菌生長，故淡竹葉甲醇提取部位對乙鏈的抑菌最小濃度為10 g•L-1。
2.3 淡竹葉甲醇提取部位化學成分液質聯用分析
2.3.1 供試品製備取浙江產淡竹葉20 g，氯仿回流提取脂溶性物質至無色，藥渣再用甲醇回流提取至無色，溶液蒸幹熱水溶解，離心，上清液過大孔樹脂，棄去水液與20％乙醇液，收集75％乙醇溶液，減壓回收溶劑至幹，甲醇定容於5 ml容量瓶中，作為供試品溶液。
2.3.2 分析條件色譜條件：色譜柱為 C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流動相為A（乙腈），B（水，0.05%甲酸）；梯度：0→15 min，A：5%→70%；B：95%→30%；流量0.5 ml•min-1；進樣量2μl；柱溫40℃；柱後分流後進入質譜儀。
質譜條件：電離源為ESI+；檢測方式為正離子模式；毛細管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為30 V；離子源溫度為120℃；掃描範圍為m/z 150～600；氮氣流量為400 L•h-1。
2.3.3 樣品分析將供試品溶液分別放入自動進樣器中，按選定的測試條件，進行檢測，得供試品的總離子流色譜圖，結果見圖1。
2.3.4 總離子流色譜圖中化合物的鑒定根據MS所測定的［M+H］+ 值及質譜圖譜，通過檢索文獻［4～6］及部分標準品對照，鑒定出6個化合物，分別為香草酸、香豆酸、牡荊苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黃酮、蘆竹素和苜蓿素。結果見表3。表3 甲醇提取部位中化學成分鑒定結果（略）
3 討論
淡竹葉抑菌實驗結果表明，甲醇提取部位對大腸杆菌、金葡菌、綠膿杆菌均有一定的抑菌作用，其中對綠膿杆菌的作用較強，對大腸杆菌的作用較弱；對乙鏈球菌也有一定的抑菌作用，其最小抑菌濃度為10g•ml-1。淡竹葉具有一定抑菌作用，但抑菌作用不強，根據這一結果，分析淡竹葉的臨床清熱作用，可能存在其它的作用機製，如增強免疫功能等。
本文首次運用HPLC-MS法對淡竹葉中有效抑菌部位（甲醇提取部位）的化學成分進行了深入分析研究，根據質譜圖譜，參考現有淡竹葉化學成分研究的文獻，並部分采用標準品對照等方法，初步鑒定出甲醇提取部位中的6個化學成分分別是香草酸、香豆酸、牡荊苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黃酮、蘆竹素和苜蓿素。現有研究結果表明，香草酸、香豆酸具有抗菌消炎作用，牡荊苷具有抗炎解痙與降壓活性，對大腸杆菌有抑製作用。從總離子流色譜圖中可以看出，淡竹葉甲醇提取部位中所含的成分十分複雜，由於淡竹葉化學成分的基礎研究薄弱，一些量大的化合物如相對保留時間為tR0.95 min，tR4.15 min，tR4.65 min，tR6.81 min等色譜峰還未能鑒定，有待進一步研究。
本文研究結果初步確立了淡竹葉中清熱解毒成分，主要是有機酸、黃酮和三萜類化合物，為淡竹葉質量標準的完善和提高奠定了實驗基礎。
【參考文獻】
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