生物標誌物(Biomarker)是微生物中含有的一些化學物質，其含量或結構具有種屬特征或與其分類位置密切相關，能夠標誌某一類或某種特定微生物的存在。這些具有分類學意義的化學物質的種類和含量可以作為鑒定微生物的指標。傳統的微生物分離培養、生化鑒定和血清學鑒定的方法越來越難以適應環境、食品、臨床標本中微生物的快速、準確檢測的要求。PCR、特異性核酸探針雜交、基因芯片、生物傳感器、免疫學技術等都是利用微生物生物學特性的檢測鑒定技術。隨著分析化學技術日新月異，很多儀器分析手段如高效液相色譜(High一performanceliquidc hromatography,H PLC) ，氣相色譜(Gasc hromatography,GC ) ，氣相色譜一質譜聯用(Gaschromatography一masssp ectrometry,GC -MS)，液相色譜一質譜聯用(LC-MS/MS)等，逐漸顯示了在微生物檢測中的潛力。這些分析化學的手段有別於依賴生物學特性的檢測方法，主要通過分析微生物的化學組成鑒定微生物，開辟了一個微生物檢測和鑒定的新途徑。
生物標誌物的種類很多，包括不飽和脂肪酸、蛋白質、核酸、類脂、磷脂、多糖和醌類等，此外還有一些特殊的化學物質僅存在於一些特定的微生物中，如芽抱中含有毗吮二狡酸(Dipicolinic acidy DAP)，分枝杆菌屬、諾卡氏菌屬、棒狀杆菌屬和紅球菌屬等都含有的分枝菌酸，也是鑒定細菌的重要物質。已有商品化的用於細菌檢測的分析化學係統，如美國MIDI公司的細菌脂肪酸GC鑒定係統、細菌分枝菌酸HPLC鑒定係統等。多數方法利用生物標記物在不同細菌中的分布譜不同鑒定細菌，在檢測這些生物標記物的過程當中，許多分析化學技術和手段相繼被建立，本文將就生物標誌物的種類、應用和發展狀況做一概述。
1 脂類
脂類是最常見的生物標誌物，在這方麵有大量的文獻報道和多種分析技術的應用，作為標誌物用於細菌鑒定早在60年代就開始了。1987年，有人用快原子轟擊質譜(Fast atom bombardment massspectrometry,FA B-MS)檢 測細菌提取物中的脂類成分，並成功地鑒定了細菌〔1,2)。脂類易於被提取和濃縮，其結構的變化與病原菌的營養和生理狀況相關，在某些情況下還可以指示細菌的傳染性，如霍亂弧菌脂類結構的變化可以指示細菌由可培養到非可培養的轉換，而非可培養菌的感染性也大大降低(3)。結核分枝杆菌表麵蠟樣結構中的微蠟樣酸和次級醇與抗藥性有關。極性脂類的結構也與培養特性有關，G一菌受氧化型生物殺滅劑作用後產生氧化型脂肪酸，氧化型脂肪酸的存在表明了細菌的非可培養性。
大多數 G +菌中支鏈C15 :。脂肪酸豐度很高，而在大多數G一菌中C16:。豐度較高(4)。一些細菌如考克斯氏體屬，土拉弗朗西絲菌屬，軍團菌屬和結核分枝杆菌屬細菌有其特殊的脂類，可經PLFA(Phospholipid fatty acid)分析實現鑒定。另外，在葡萄球菌屬，鞘氨醇單胞菌屬，假單胞菌屬和梭菌屬中存在屬特異性的脂類，通過分析不同菌種脂類結構的特點還可進一步提高脂類分析的特異性
Sm ith 等 用ESI-MS( El ectorsprayio nizationm assspectrometry)檢測細菌中的甘油磷酸脂。MS/MS分析得到的有意義的信息主要是酞基(R-CO:一)的種類及其強度，該報道分析了三種芽抱杆菌屬細菌和大腸杆菌的氯仿一甲醇提取物，發現它們的甘油磷酸脂成分有明顯的區別，同時作者也提到必需將細菌在標準的條件下培養才能用這種方法鑒定細菌(9lo B orrett等用ESI-MS的檢測方法研究大腸杆菌和炭疽杆菌的脂肪酸成分經乙醇或次氯酸鹽消毒處理後的變化，表明這種方法可以對已消毒的細菌進行鑒定。
目前 已 有一種商業化的細菌脂肪酸甲醋(FAME)G C分析係統，稱Sherlock係統(美國MIDI公司)。細菌在標準的培養條件下培養和收獲，經過有機溶劑的萃取和甲醋化，注人GC係統中分析，一個分析周期約2h(細菌培養時間除外)。脂肪酸定性由Sherlock係統根據細菌脂肪酸譜中色譜峰的tR，檢索其內置的脂肪酸庫而完成(其數據庫的範圍限於012,0-C20;。的脂肪酸)，經百分歸一化處理，給出相對定量數據。本實驗室曾利用該係統分析了32個需氧芽胞杆菌的繁殖體和芽胞的脂肪酸成份，並得到一些有意義的分類學結果。
Bas ile 等 報道了一種可移動式熱裂解質譜(Py-orlysism asssp ectrometry, Py -MS)方法。細菌全細胞(約107-108個)與甲基化試劑混合後經熱裂解，由毛細石英管導人EI源，質量分析器為離子阱型。測定了鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西絲菌、布魯氏菌、炭疽芽胞杆菌的脂肪酸甲醋，與經標準MIDI係統樣品處理後的Py-MS質譜圖有很好的對應關係。Py-MS采用原位熱裂解甲醋化，樣品處理隻需30 s,分析周期僅為10 min。而且除脂肪酸外，還檢測到了芽抱中的特殊成分DPA的甲醋化衍生物。根據四種生物戰劑質譜圖中峰位和峰強的不同，極易將它們區分開。其缺點是仍免不了細菌的分純培養過程。
與甲基化試劑混合後經熱裂解，由毛細石英管導人EI源，質量分析器為離子阱型。測定了鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗朗西絲菌、布魯氏菌、炭疽芽胞杆菌的脂肪酸甲醋，與經標準MIDI係統樣品處理後的Py-MS質譜圖有很好的對應關係。Py-MS采用原位熱裂解甲醋化，樣品處理隻需30 s,分析周期僅為10 min。而且除脂肪酸外，還檢測到了芽抱中的特殊成分DPA的甲醋化衍生物。根據四種生物戰劑質譜圖中峰位和峰強的不同，極易將它們區分開。其缺點是仍免不了細菌的分純培養過程。
2 醌類
醌類幾乎存在於所有生物中，主要包括泛醌和甲基蔡醌類。每種細菌都有一種主要的醌類成分，一個微生物群體中釀類的種類和數量的不同反映了群體組成的多樣性，釀類譜已經作為指示細菌群體組成多樣性的一個指標在環境微生物學中廣泛使用〔13)0醌類在細菌和真核生物中是需氧呼吸鏈上的電子傳遞體，其結構中的異戊二烯側鏈的長度有重要的分類學意義。真核生物線粒體主要含UQ10,G一菌主要含有UQ4一UQ10，兼性厭氧菌如大腸杆菌還含有蔡醌、甲基禁醌、去甲基蔡釀，而古細菌缺乏泛醌(14)a切de等報道提取細菌細胞中的中性脂類，用LC-MS檢測環境中的泛醌，最低檢測限為9ppb，相當於1.29 x 10 ，個細菌〔'5)o N ishijima等人用Frit-FAB(Frit-fast atom bombardment)和HPLCMS聯用技術檢測了15種標準菌株的泛醌、甲基釀
及其類似物。該方法利用色譜保留時間、UV檢測和MS檢測的信息，可以得知醌類的組成和含量。
3 脂多糖和脂寡糖
脂寡糖 (Lipooligosaccharides,LO S)和脂多糖(Li popolysaccharides,LP S)是G一菌細胞表麵重要的抗原決定簇，特定的分子組成決定著抗原的結構和宿主與病原之間的相互作用。文獻報道用ESI-MS分析流感嗜血杆菌、杜克萊氏嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌、傷寒沙門氏菌的LOS和LPS的0一去酸基產物的方法，作者認為在對LOS/LPS結構了解的情況下可以實現這些菌株的鑒定。由於 外 界 環境的刺激會使LOS/LPS有所變化，它不十分適合用來鑒定細菌，但是LOS/LPS是血清型劃分的基礎，因此分析這些物質的含量能夠建立生物學分型和化學分型之間的關係。用MS的手段分析臨床分離病原菌的LOS/LPS，還可了解LOS/LPS的結構和致病性之間的關係。
4 分枝菌酸
分枝杆菌屬、諾卡氏菌屬、棒狀杆菌屬和紅球菌屬的細菌中含有分枝菌酸，不同種屬的細菌所含分枝菌酸的組成恒定，且各不相同，計算HPLC色譜圖中色譜峰的相對峰高比和相對保留時間對於鑒定這些細菌有重要意義。Butler等用HPLC鑒別了來自這幾個屬的細菌，並且就高效液相色譜分析分枝菌酸在鑒定細菌中的應用做了全麵綜述〔021, K ellogg等用MIDI公司的SMIS(Sherlock mycobacteria identificationsystem)係統分析了370株分枝杆菌屬的分離株，正確率為75%，經過計算相對峰高比和相對保留時間校正，原來沒有正確鑒定的菌株90%以上都實現了正確鑒定〔2')o C hou等報道了用氣相色譜檢測分枝杆菌屬中10個種的29株細菌的脂肪酸、次級醇和分枝菌酸，正確鑒定了全部60個從痰液中得到的分離株，用在Bactec 7H12 B基質上培養6天的培養物作為分析的樣品，大大的縮短了此類細菌的鑒定時間。
5 多糖
細菌的多糖占其幹重的0.1%一2%，兩以用於種屬鑒定和推測細菌的生理狀況。附表列舉了一些多糖在細菌中特異性的分布, HPLC測定多糖和糖蛋白中分離出的糖已經是比較成熟的方法，全細胞裂解液中多糖成分的測定可以為分類學提供有意義的信息。GC-MS/MS檢測環境樣品和臨床標本中細菌多糖的醇醛酸衍生物具有高靈敏度、高特異性，Fox就GC-MS檢測複雜基質中細菌糖類成分做了全麵綜述。通過水解把細菌全細胞中的多糖釋放出來，然後加人衍生化試劑反應生成糖的醇醛酸形式，再進行GC-MS分析。目前這一樣品處理方法已經可以實現自動化，為細菌多糖成分全自動分析及其儀器化奠定了基礎。蠟樣 芽 胞 杆菌、蘇雲金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌的表型和基因型非常接近，正確鑒定、區分三者一直是細菌分類鑒定中的一個難題。在多糖成分的GCMs圖中，炭疽芽胞多糖成分也有顯著的高於其餘兩者，而枯草芽胞杆菌的甘露糖氨顯著低於前三者。它們的芽胞多糖成分也有明顯的區別，炭疽芽胞杆菌隻含有鼠李糖和3-0一甲基鼠李糖，其它三者還含有海藻糖和2一甲基鼠李糖。
6 胞壁酸
胞壁酸是所有真細菌(除支原體和衣原體外)細胞壁中特有的氨基糖，在自然界其它生物包括動物細胞、體液、真菌中都不存在，占細菌幹重的4%，可作為從複雜的生物、環境樣本中檢測痕量細菌的一個標記分子。胞壁酸(Muramic acid)的檢測往往需要衍生化過程，如胞壁酸的丹磺酞衍生物，三氟乙酞化衍生物和三甲基矽烷化衍生物等，檢測手段主要是LC-MS,GC-MS等(25)。通過酸水解把胞壁酸釋放出來，中和多餘的酸，再加人一定量的內標，經MS/MS測定可以給出定性定量結果。類似的其它氨基糖也可以用作化學分類的標誌物，如軍團杆菌屬中的異鼠李糖胺(Quinovosamine)和岩藻聚糖胺(Fu cosamine) ，半乳糖胺的含量不同可區分炭疽芽胞杆菌和蠟樣芽胞杆菌〔26)o K ozar(27〕等分析了灰塵和空氣樣品中的胞壁酸，樣品經過分離純化和鹵化衍生化進行GC-MS/MS分析，檢測樣品為物體表麵灰塵和室外空氣樣品，胞壁酸含量分別為1.66 n 歲ml和1.4/5.9 n留ml, Black等用硫酸裂解細菌全細胞，然後用有機堿性溶劑中和過量的酸，注人ESIMS/MS直接分析未經衍生化的胞壁酸，作者采用了多反應監測掃描(Multiple reaction monitoring)可以提高選擇性和靈敏度，避免了繁瑣的衍生化步驟。
7 蛋白質
細菌基因組約編碼幾千個蛋白質，其種類多、分子量覆蓋範圍廣使得以其中某一種蛋白質特異地鑒定某種細菌幾乎是不可能的。但是，正是由於蛋白質的多樣性和豐富性，利用菌體內的多個蛋白質質量信息的分析方法很有希望成為鑒定細菌更為有效的手段。目前，以蛋白質為靶分子鑒定細菌的報道很多，有以下方麵的研究結果。
7.1 以一組細菌的蛋白質圖譜的差異為鑒定指標研究
幾種近源菌或相關菌蛋白質圖譜的差異，把這些差異做為鑒定細菌的指標。Krishnamurthy等報道用LC/ESI-MS為檢測手段，分析了9種不同種屬的細菌。用含0-20%乙睛的0.1 % TFA懸浮冷凍幹燥的細菌，濃度為0.6V g /閃，渦流2m in，離心2min，上清液用濾膜過濾，注人HPLC係統。LC-MS分析時間僅為12 min。蠟樣芽胞杆菌、蘇雲金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌在此分析條件下各有其特異的蛋白質，非常容易區分，此外它們還有種內共有的標誌物。Hendrickera等以熱裂解質譜為檢測手段，以鼠疫耶爾森氏菌、炭疽芽胞杆菌、土拉弗朗西絲菌、布魯氏菌的菌懸液為標本，檢測了脂肪酸、DPA,DNA、蛋白質降解物的氫氧化四乙基胺甲醋化產物，用統計學方法判讀結果('0),, DNA在此條件下降解為單個堿基，蛋白質降解為非常短的膚，質譜檢測範圍在400 D以下，對54份樣品各分析4次，整個分析的正確率為98%。但是，用這種方法鑒定細菌的能力僅局限於研究範圍之內的細菌，對於其它未知菌的鑒定還是無能為力。Conway等將pap操縱子克隆入pACYCl8鬥，然後把重組質粒pRHU-845導人大腸杆菌。已知pap編碼蛋白的分子量為16554 D,用MALDI-TOF MS分析，重組大腸杆菌(pRHU-845/pap幹)比未重組大腸杆菌(pACYC184/pap一)多一個m/z'16 556.9 D的質譜峰，表明單一的蛋白的差別可以通過質譜分析顯現出來，為檢測可能的基因重組微生物提供了重要手段。
7.2 根據某科、屬的細菌蛋白質圖譜做分類學研究
Con wa y等 分析了25種致病性大腸杆菌和9種腸杆菌科其它屬的細菌，檢測到40一100個質譜峰，分子量最大達到25 kD(3'l。細菌過夜培養、收集後冷凍幹燥，製成1 m留m1的菌液，與。一輕基肉桂酸的飽和溶液相混合，用MALDI-TOF MS(Matrix assis-ted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)檢測，檢測限為1.8 x 1 0，個菌。用溶菌酶處理細菌，質譜圖上並沒有增加色譜峰;在溶菌酶處理細菌後，用蛋白酶K消化，所有的蛋白質質譜峰都消失了，證明本方法可以檢測細胞內的蛋白質。
大腸杆菌不同株的MALDI-TOF質譜圖之間既存在特異的峰又有很大的相似性，易與其它腸杆菌科的細菌(包括沙門氏菌和誌賀氏菌)相區分。
7.3 用未知菌的質譜圖檢索標準菌株的蛋白質指紋圖譜庫
首先 建 立 標準菌株的蛋白質指紋圖譜庫，未知菌株經標準程序分析，通過一定的數理統計方法進行數據庫檢索。該方法對數據庫的容量，包括數據庫中不同菌種、菌株的覆蓋範圍有很大的依賴性，要求分析方法在一定的細菌培養和質譜分析條件下重現性好。英國Micromass公司的MALDI-TOF線性飛行時間質譜儀配有60多個屬，300多種細菌的指紋圖譜數據庫，供用戶檢索使用。該軟件還允許用戶自定義數據庫，用戶可以自行標準化從細菌培養到質譜分析的過程，建立由目標菌株構成的數據庫，可以大大提高鑒定的準確性和拓展應用範圍。
7.4 用未知菌的質譜圖檢索蛋白質分子量數據庫
微生物基因組學和蛋白質組學的研究提供了日益豐富的蛋白質數據，為MS鑒定細菌開辟了新途徑。其基本思路是用未知菌的質譜峰與蛋白質數據庫中(如Swiss-Prot)已知菌的蛋白質分子量相匹配，匹配率最高的為未知菌的鑒定結果。利用軟件調取細菌某一範圍內全部蛋白質的分子量作為參照，將得到的質譜峰與其相對照，通過數理統計軟件分析給出鑒定結果。
Dai等用HPLC分離大腸杆菌裂解液中的各個成分，把收集到的流份做MALDITOFMS分析。發現與細菌裂解液直接用MALDI-TOF的質譜圖相比較，在2一19 kD範圍內多檢出300多個蛋白質，尤其是高分子量蛋白質增加了很多，說明細菌裂解液中的某些物質對MALDITOFMS分析可能有離子抑製效應。作者還對比了不同文獻中報道的大腸杆菌的質譜峰。由於各文獻中樣品處理方法和儀器的參數條件各有不同，得到的質譜峰也各不相同，但是幾乎所有的分子量都可以在HPLC收集的流份中找到相應的蛋白，而且在實驗上論證了上述途徑的可行性。隨著細菌基因組全序列信息的不斷積累，可以利用的蛋白質信息將越來越多。這種方法在病毒鑒定中同樣適用，如Yao等用MALDI-TOFMS分析了空氣樣品中委內瑞拉馬腦炎病毒的胰蛋白酶降解物37。利用六個已測序的病毒基因組數據，計算其理論胰蛋白酶降解的膚圖譜，構成數據庫。經數據庫檢索，準確的鑒定了該病毒。
高分辨質 譜和多級質譜檢測具有高選擇性和高特異性，如MALDI中的源後延遲技術Post sourcedecay PSD )三重四級杆和離子阱型質量分析器等。這些手段可以從大量的環境物質和背景中檢測到特定微生物的生物標誌物，還可獲得該分子的結構信息，但是這種鑒定手段依賴於對致病菌的生物標誌物結構的清晰認識。
8 核酸
在 MA LD I-TOF和ESI-MS方式下，寡核昔酸片段容易帶有一個或多個負電荷，以負離子形式被檢測。質粒經限製性內切酶消化，得到大小不等的片段，用MS檢測片段的分子量可以鑒定某一質粒。Bai等報道將細菌的B6 BLEU5質粒用Alul或Hae1II酶切，質粒大小為4 658坤，得到27個大小22一267by的片段，這些片段以ss-DNA的形式離子化，與預期的片段分子量相符合，但是小於20 nt和大於70nt的片段沒有檢出。
最近，Wintzingerode等報道了一種用MALDI-TOF分析16 S rRNA堿基特異性片段實現細菌快速鑒定的方法。在PCR反應中，用d-UTP代替d-TTP，以350帥長度的16 S rDNA單鏈為模板擴增，該片段包括了高度變異區V1和V2o PCR產物經d-UTP糖基化水解酶水解後得到DNA片段，用MALDI-TOF MS分析這些片段的質譜圖，與已公布的16S rRNA序列的計算值相比較，可以區分在此片段中僅相差單個堿基的菌株該方法不需細菌培養過程，靶基因也不僅局限於16SrRNA，同樣適用於其它基因分型標記分子。這一方法對於非可培養的和難培養細菌具有重要價值。VN RT (V ariablen umberta ndem repeat)技術在個體識別、基因定位及基因診斷方麵有較高的應用價值，在細菌鑒定中可以用於細菌的來源追蹤。用VNTR技術分析來自佛羅裏達州、紐約和華盛頓特區的郵件中的炭疽芽胞杆菌分離株，證實它們是同一來源，這株菌來源於1981年從德克薩斯州死牛中分離出一株菌，該株菌被命名為Ames株。
9 其它
除了上述幾種類型的生物標誌物外，其它種類的生物標誌物相對較少一些。這是因為脂類、多糖、蛋白質、核酸在細菌內含量較高，種類繁多。還有一些小分子的物質也被用來作為鑒定特定微生物的生物標誌物。
DPA( 毗 吮-2,6一二梭酸)是所有細菌芽胞中特有的一種成分，是區分細菌芽胞和繁殖體的標誌物。Goodacre等用巧-MS和傅立葉變換一紅外光譜(FTIR)檢測DPA,m /z1 05為DPA的特征碎片峰;144一1439 cm -’代表了比吮環的振動，該方法對26株實驗菌株都能正確判定以芽胞還是繁殖體的形式存在(41)o B evaerly等報道用Py-MS檢測DPA，分析時間(包括樣品製備)僅10 min，靈敏度為2.2 X 107CFU。
用經典的生化反應難以檢測和鑒定厭氧菌，有人建議通過檢測細菌的代謝終產物鑒定細菌，但是從細菌的代謝終產物中找到穩定的標誌物比較困難。Arellano等報道，用毛細管電泳一紫外(Capillaryelectrophoresis-ultrav iolet,CE -UV)檢測分析厭氧菌的短鏈脂肪酸，如唬拍酸、丙酮酸、乳酸、丙酸等，共分析了17個種和亞種的11種短鏈脂肪酸成分，G`菌和G一菌的色譜圖有很大的區別，但是，僅依賴短鏈脂肪酸成分並不能準確地將目標菌鑒定到種的水平。
二醇 、 街 醇、甘油在評價微生物種群的結構和生理狀況方麵很有意義。細胞死亡後，在內源性或外源性的磷脂酶的作用下迅速生成甘油二醋〔’〕。這些分子需要經過衍生化，以適合用ESI-MS檢測。
10 展望
隨著分析技術的進步和分析微生物學的不斷發展，利用生物標誌物鑒定微生物的方法將會對臨床診斷、環境監測、食品檢測產生重大的影響。在某些情況下，分析目標微生物中生物標誌物的組成不僅可以確定該微生物的屬、種，還可以確定其具體來源於哪個保藏種，在生物恐怖和生物戰發生時快速鑒定細菌來源對於事件性質的判斷具有重要意義。當然，這需要更為精確的分析方法和相應的數據庫支持。
盡管以上列舉了多種類型的生物標誌物，仍然很難找到一種在某種、某類微生物中獨有的化合物。
目前，幾乎所有通過分析生物標誌物而檢測和鑒定細菌的方法都是獲得某類標誌物的分布和含量譜，根據不同的微生物中該標誌物的分布不同鑒定目標微生物。建立各種生物標誌物在微生物中分布情況的數據庫及相應的標準分析程序，仍然是建立微生物檢測係統的主要方向。為了提高鑒定的準確性，還可以集合幾種方法同時檢測幾種生物標誌物，綜合判斷鑒定結果。
另外 ， 一些生物標誌物的分析方法比較繁瑣，涉及到分離、提取、衍生化等步驟，耗時數小時，隨著分析技術的進步和各種標誌物數據庫的完善，這些方法將會向更加簡便、迅速、準確和自動化的方向發展。
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