口蹄疫病毒免疫 動物在自然感 染口蹄疫病毒耐過以後,具有相當堅強的免疫力。牛耐過口蹄疫後具有一年半左右的免疫性 。豬的病後獲得性免疫可達10~12個月,豚鼠為3~4個月。隱性感染動物也有免疫力。免疫 強度與血液中的 中和抗體水平相符。初期抗體為IgM,開始出現於感染後的第9天，但僅保持一個月。IgG抗體 出現於感染後10～14天，並可長期持續幾個月到一年以上。這兩種免疫球蛋白都有明顯的中 和及抗感染作用。但是必須指出，上述免疫隻對同型病毒有效。在口蹄疫流行地區，在疫情 停息後幾個月至1年左右時間內再次暴發疫情，大多是由異型或同型中不同亞型的毒株引起 。注射恢複動物的全血、血漿或血清，可以產生被動免疫，保護易感動物不受感染。但免 疫期甚短，一般不超過2周，主要用於疫情暴發時對仔豬和犢牛等提供緊急保護。免疫或 恢複動物的抗體，可以通過初乳傳遞給仔畜。初生犢牛血清中沒有免疫球蛋白，但在吸吮免 疫母牛的初乳後2小時，即可在其血清中測出抗體。這種母源抗體的存在，固然具有一定的 抗感染作用，但也可使犢牛對活毒疫苗接種不發生反應，導致免疫注射無效。人工免疫注射包括弱毒疫苗和滅活疫苗兩種。弱毒疫苗常可提供較好的免疫力，免疫持續 時間也 較長。除能引起循環抗體以外，還使接種動物產生某種程度的局部免疫，例如在唾液和鼻分 泌物中出現分泌性IgA。弱毒疫苗劑量小，價格低廉，兔化或鼠化等弱毒疫苗甚至可在基層 單位就地製造。但是必須指出，目前所用的弱毒疫苗的致弱程度，常隨動物種類而不同，例 如對牛沒有毒力或毒力很低的疫苗株，可能對豬仍有致病力。即使在牛，弱毒疫苗株對於不 同品種、年齡和生理狀態(如懷孕)的動物也常表現不同的殘留毒力。弱毒疫苗中的活病 毒可能在畜體和肉品內長期存在，構成疫病散布的潛在威脅，而病毒在多代通過易感動物後 可能出現的毒力增強——返祖，更是一個不可忽視的危險。因此，許多歐洲國家以及北美、 澳 大利亞、新西蘭等沒有口蹄疫疫情的國家和地區均已明文規定禁止使用弱毒活疫苗。南美一 些國家曾經使用弱毒疫苗，但因歐洲的肉食進口國家提出異議，現已大多停用。我國亦已開 始禁用弱毒活疫苗。
防製口蹄疫，目前大致采取三種方法：
(1)廣泛進行免疫預防，也就 是對所有的易感動物進行係統的預防注射；
(2)如果疫區不大，疫點不多，在經濟條件許可 的情況下，撲殺疫區內的病畜和易感動物，並在周圍10公裏內進行環形預防注射，也就是所 謂的包圍圈式免疫預防；
(3)在很少發 生或沒有口蹄疫的國家和地區，一旦發生疫情，采取斷然措施，撲殺疫區內所有的牲畜，徹 底消毒。采取上述三種方法中的哪一種，決定於疫情流行情況以及社會—經濟條件等許多因 素。發達國家都是采取檢疫、封鎖、屠殺和消毒等措施防製和消滅疫病。疫苗接種對牛具有較好的保護力，但豬的免疫力的產生遠比牛為困難。用於豬的口蹄疫疫 苗 ，特別是滅活疫苗中的含毒量必須比牛大3～10倍，且應加有皂素、明礬或油包水型乳劑等 佐劑。
弱毒活疫苗— 目前應用的弱毒疫苗株包括鼠化、兔化、雞胚化以及組織 培養細胞馴化毒等，各學者所用的原始毒種以及馴化培育的方法和條件不盡一致。還有以人 工誘變或突變體篩選等方法選育的弱毒株，如溫度敏感(ts)株等。由於這些毒株在致弱程度 和免疫原性上都還不夠理想，因此馴化工作仍在繼續，而且往往交叉進行，例如將鼠化毒株 再 經雞胚、組織培養細胞或兔體傳代以及將兔化毒株進一步通過組織培養細胞等等。目前有關 這些疫苗株的毒力、免疫原性和實際應用方麵的報道較多，但互相間存在一些矛盾，甚至比 較明顯的矛盾。故在應用上述疫苗進行免疫注射時，必須嚴格遵照各該疫苗的使用說明以及 保存和運輸規定。由於口蹄疫的廣泛流行以及防疫上的大規模需要，弱毒疫苗在免疫效力 和經濟上都曾有過很高的吸引力，特別是在應用弱毒疫苗成功地消滅或控製了天花、黃 熱病等先例的鼓舞下，許多實驗室開展了口蹄疫弱毒苗的研究。但是實踐結果往往不夠理想 。雖然許多學者應用不同的毒株進行了各種途徑的傳代馴化及純株(克隆化)病毒的挑選，先 後培育出了多達幾十個弱毒疫苗株。但是可以這樣認為，迄今還無一個可以滿足所有要求標 準的口蹄疫弱毒疫苗株。理想的弱毒疫苗株應該致弱程度適當，能在動物體內增殖，引起較 好的免疫反應，但又不致產生機體損傷，多代通過敏感動物，毒力不會增高，而且可以應用 於牛、羊、豬等多種動物。而在現有的幾十個弱毒疫苗株中，或則毒力過弱，缺乏免疫原性 ；或則毒力過高，經常引起機體損傷，以至明顯的發病症狀；有的在實驗室內證明沒有毒力 ， 但在應用於不同生理應激水平的動物，例如懷孕、泌乳的母牛以及犢牛和仔豬，往往可以致 病，甚至引起死亡。應用寡核苷酸指紋圖譜分析以及等電聚焦電泳等技術，發現80年代發生 於歐洲的幾次口蹄疫流行均與疫苗毒株有關，例如在1984～1985年意大利發生的口蹄疫流行 中，分離的毒株與疫苗株A5 parma 62有關；1984年暴發於前西德的口蹄疫由疫苗A5 Al lier 60所致；82年暴發於丹麥和前西德慕尼黑的口蹄疫是由疫苗毒株O1 Ausamn 65引起 的……等等。且如上述，對一種動物的減毒，並不保證對其它動物的減毒。再者，由於新的 病毒亞型不斷地自然出現或從其它地區傳入，而毒株致弱的結果以及達到致弱所需的時間， 卻都不能預言，不能適應防製新亞型的需要。因此，盡管弱毒疫苗株的馴化培育研究仍在繼 續，並已開始應用基因重組等新技術，但在許多國家和地區，口蹄疫的預防接種幾乎都是采 用滅活疫苗。
滅活疫苗— 關於滅活疫苗的製造方法，大致可分為四個階段。
①1939年，Sc hmidt和Waldmann等將口蹄疫病毒接種於屠宰前健康牛的舌皮內，待其發病後，采取病牛 舌部的水皰皮和水皰液，加入氫氧化鋁凝膠進行吸附，隨後再用甲醛滅活，製得了具有較高 免疫保護力的疫苗。這種疫苗量少價貴，飼養病牛又有嚴重散毒的危險，現已摒棄不用。
②1947年，Frenkel從新屠宰的健康牛舌上采取上皮組織，迅速剪碎後，置於培養罐內， 同時加入營養液和病毒，使病毒在存活的上皮組織片內大量增殖，隨後加入滅活劑和佐劑製 成疫苗。Frenkel疫苗提供了大規模生產疫苗的方法。在口蹄疫，特別是歐洲口蹄疫的防製 上起到過重要的作用。
③1962～1963年，Ubertini等應用犢牛腎細胞在大罐內培養口蹄疫 病毒，生產出大量優質疫苗。1962年，Mowat和Chapman等開始應用乳倉鼠腎傳代細胞(BHK 21)培養口蹄疫病毒，並製造疫苗。
④1966年，Capstick和Telling等建立了應用BHK 21細胞深層懸浮培養法製備口蹄疫疫苗的基本方法。隨著生產工藝的改進，現在已可成功地 應用容量達800萬ml以上的大發酵罐大量培養細胞、增殖病毒和製造疫苗。英國於1984年 在Pirbright建立了國際疫苗庫，可為其成員國緊急生產滅活疫苗，保存有A24、O1 、C1和Asial等亞型的疫苗病毒株，在液氮中貯存可供50萬頭牛用的疫苗濃縮製劑，並配 備有迅速 配製和分裝疫苗的實驗室。定期用牛和豚鼠監測其保護力，進行一係列生物學試驗。保存一 年的疫苗沒有發生任何降解。深層懸浮培養法應用密閉係統的大發酵罐培養細胞。以改良 Eagle氏液作為培養液，用自動調節的濾過空氣和二氧化碳控製酸堿度。細胞在不斷攪拌的 懸浮狀態下增殖，溫度自動調節為36℃左右。最常應用的細胞是適於懸浮培養的BHK21克 隆 13細胞株，但也有應用IFFA3細胞或IBRS2細胞的。當細胞數增殖至3×106/ml時，即 可接種病毒，並於接毒後20~30小時收毒，此時病毒滴度一般可達107~108TCID50 /01ml。於病毒液內加入乙酰乙烯亞胺(AEI)作滅活劑，以氫氧化鋁或皂素為佐劑，製成滅 活疫苗。除上述懸浮培養方法以外，也有應用BHK21等的單層細胞培養物增殖病毒，隨 後加入甲醛、二乙烯亞胺(BEI)或β丙內酯等滅活劑滅活，並以氫氧化鋁、皂素、弗氏不 完全佐劑 或油包水型乳劑等作為佐劑疫苗。應用微載體或中空纖維培養技術，可使單位體積內的細 胞密度比懸浮培養法高幾倍到幾十倍，從而得以明顯提高培養病毒的滴度。具體方法請參閱 本書第十一章有關節段。西歐最近發現，近年來的許多次口蹄疫暴發似與滅活疫苗中的殘 留活病毒有關。其它地區也有類似報告。這種情況促進了亞單位疫苗的製備研究，亦即製造 隻含病毒蛋白而無病毒核酸的口蹄疫免疫製劑。Kupper等成功地製備和濃縮了口蹄 疫病毒的衣殼蛋白VP1。法國和美國的研究工作者也已證明，由破裂的病毒粒子中提取的 純化VP1能夠使豚鼠和豬發生抗體反應，大劑量時更能使豬獲得對隨後感染的免疫力。 在應用基因工程製備口蹄疫疫苗方麵，亦已取得明顯突破。許多 國家先後報道過口蹄疫病毒免疫原性蛋白VP1核苷酸序列的克隆和表達，表達產物能使 被接種動物產生一定程度的免疫保護力。以反轉錄酶由口蹄疫病毒RNA合成單股cDNA，再用D NA聚合酶使其複製成雙股。在與質粒DNA重組後引入大腸杆菌進行擴增。提取內含插入基因 的質粒，以限製內切酶切取插入基因副本，除去不必要的堿基序列後，再行插入表達質粒， 並轉化大腸杆菌，使其表達並產生病毒蛋白。每個細菌約能產生106個LEVP1分子， 相當於菌體重量的17%。用少數豬、牛作免疫接種試驗，表現有保護作用。Bittle氏等(19 82年)化學合成了VP1 141~160號氨基酸的合成肽與鑰孔 蟲 戚 血蘭蛋白(KLH)偶聯，具有較好的免疫原性，開創了合成肽疫苗的光輝前景。應 用VP1 141～158號和200～213號氨基酸組成的40個氨基酸的合成肽即使沒有載體，也能產 生對牛的較 好的保護力。根據141～160和200～213號肽段是決定免疫原性的抗原活性簇，鄭兆鑫等(1 994)合成了編碼該兩肽段的基因片段，構建了編碼帶有Lac啟動子和編碼590個氨基酸的β 半乳糖苷酶基因的表達質粒，在酶基因的C末端與排列為AA140～160AA200～213AA 141～160的口蹄疫病毒串聯基因相連結。重組質粒轉入大腸杆菌後，能表達具有免疫原性的 抗 原蛋白。用含抗原融合蛋白包涵體400ug二次注射豚鼠，45天後的保護率100%，160天後為66 7%;給豬注射二次，分別含抗原融合蛋白的包涵體53mg和34mg，60天後的保護率為100 %，143天後為80%。Mckenna等(1995)通過基因工程技術,構建了一株缺失RGD(精氨酸甘氨酸天門冬氨酸)的 口蹄疫病毒,由於RGD是病毒蛋白衣殼上負責與細胞結和的特異部位,因此,缺失RGD就消除了 病毒結合細胞的能力。應用這種缺失受體結合位點的口蹄疫病毒給牛接種,可以使其產生抵 抗強毒株攻擊的免疫力。
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