農杆菌介導的植物遺傳轉化

3．YEP培養基：每升含有：牛肉浸膏 10 g ，酵母提取液 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.0

4．實生苗培養基： 1/2MS培養基，附加30g蔗糖和0.6％瓊脂，PH=6.0。
　　5．預培養基：MS+1.0～1.2mg/L  2，4-D+0.2mg/L 6-BA+30g蔗糖+6g瓊脂，PH=5.8。
　　6．分化培養基：MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+30g蔗糖+6.5g瓊脂+AgNO36mg/L， PH=5.8。
　　7．篩選培養基：分化培養基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L Kan，PH=5.8。
　　（三）試驗儀器
　　超級超淨工作台
　　智能氣候培養箱
　　大型落地式高速冷凍離心機
　　凝膠成像係統
　　台式常溫高速離心機
　　立式滅菌鍋
     電泳相關設備
　　（四）農杆菌介導植物轉化實驗步驟（以油菜子葉轉化為例）
　　1．根癌農杆菌的培養
　　將保存於甘油中的菌種用劃線法接種於LB固體平板培養基上培養，每次轉化前一天從平板上挑取單菌落接種於YEB液體培養基中，在26℃，170r/min的搖床上過夜培養，當OD600值達0.3～0.5時，將其在4000r/min的條件下離心5min，棄去上清，然後用液體MS培養基將其重懸稀釋5～8倍待用。

2．建立無菌苗
　　將油菜種子用75%酒精浸泡30s後，於0.1%HgCl2溶液中處理10min，無菌水衝洗3次後，接種於1/2MS固體培養基上，在25±1℃黑暗條件下培養3d，後移至光下培養1～3d，取其下胚軸和帶柄子葉接種在預培養基上，在25℃，光照強度為2000lux，16h光照周期培養條件下培養，待用。
　　3．農杆菌侵染
　　在無菌條件下，將預培養2d子葉和下胚軸收集於一個無菌小燒杯中，浸入於活化並稀釋了5～8倍的農杆菌液中，5min後轉到無菌濾紙上，吸幹多餘的菌液，接至共培養培養基中，在25℃生化培養箱中共培養2 d。
　　4．分化培養 
　　將共培養2d的受體材料先用無菌水衝洗2～3次至水澄清後，用500mg/LCef浸泡30～40min，材料取出並置於含有無菌濾紙的培養皿中幹燥2d。將培養物轉移至附加8～15mg/L卡那黴素和500mg羧苄青黴素（或頭孢黴素）的分化培養基中，在25℃，晝夜光周期為16／8h恒定光照條件下培養，
　　5．篩選培養
　　將分化培養中獲得的綠芽移置篩選培養基（卡那黴素濃度升致25mg/L），每隔15～20d轉接一次。
　

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