人群腦膜炎奈瑟菌帶菌檢驗方法的研究

【摘要】  目的：研製一種能夠在低溫下保持腦膜炎奈瑟菌活性並具有增菌作用的培養基。方法：配製一種小牛血清“雙抗”培養基，用已知量A、C群腦膜炎奈瑟菌檢定其保菌和增菌效果，並用該法在正常人群中檢測帶菌率，以常規方法的檢測結果作配對比較。結果：應用小牛血清“雙抗”培養基可使腦膜炎奈瑟菌在4 ℃ 24小時內基本不死亡，部分菌株可生存8天，同時可使存活的細菌從3~9 CFU/ml增加到(6~7)×107 CFU/ml；對364名正常人檢測，其檢出率達1.65%,而常規方法檢出率為0(P<0.05)。結論：小牛血清“雙抗”培養基在4 ℃的不利條件下，有顯著保菌作用，同時具有顯著增菌作用。

【關鍵詞】  腦膜炎奈瑟菌；檢驗方法；小牛血清；保菌；增菌

    [Abstract]   Objective：  To manufacture one culture medium (for short: new medium) which could keep the life of Neisseria(N.) meningitidis in low temperature, and could augment the number of N.meningitidis.  Methods: One culture medium containing new bovine serum and two kinds of antibiotic was prepared. The effects of  keeping life of  N.meningitidis were detected by  known number of A and C types of N.meningitidis. Then carriers of N.meningitidis in the crowd were detected, compared with the routine detecting method as control.  Results: The new medium could almost keep the life of N.meningitidis for 24 hours in 4 ℃ , and could augment the number of N.meningitidis from 3~9 CFU/ml to （6~7）×107 CFU/ml in 37 ℃. Some strains of M.meningitidis could live for 8 days in the new medium in 4 ℃. With 364 healthy persons detected with the new medium, the positive rate of carrying N.meningitidis was 1.65%, but with routine detecting method, the positive rate was 0 (P﹤0.05).  Conclusion:  In nfavourable condition of 4 ℃, the new medium could keep the life of N.meningitidis distinguishingly. And in the favourable condition of  37 ℃, the new medium had the function of augmenting the number of N.meningitidis prominently.

    [Key words]      Neisseria meningitidis; Detect method; New bovine serum; Keep the life of bacteria; Augment the number of bacteria

    腦膜炎奈瑟菌對幹燥、寒冷、熱、陽光等非常敏感，在室溫中3小時就死亡[1]，同時營養要求也很高。因而對腦膜炎患者或帶菌者的檢查，常規的檢驗方法需要用37 ℃預溫的巧克力色血瓊脂平板進行床邊接種，並保溫運送至實驗室檢驗，這種方法對人群帶菌狀況和流行病學的監測尤其困難。為方便監測並反映人群的真正帶菌狀況，就如何保持腦膜炎奈瑟菌的活性、提高檢出率，我們對所用培養基進行了研究。

    1   材料與方法

    1.1   小牛血清瓊脂   將市售血瓊脂基礎培養基配製後121 ℃15分鍾滅菌，待冷卻至50 ℃左右時，按10%加入小牛血清，作腦膜炎奈瑟菌活菌計數時傾注平板用。葡萄糖蛋白腖水: 含1 %葡萄糖、1%蛋白腖、0.5%氯化鈉，121 ℃15分鍾滅菌後備用。小牛血清“雙抗”培養基[1]：取上述製備的葡萄糖蛋白腖水溶液198 ml、“雙抗”水溶液2 ml（萬古黴素、多黏菌素B的濃度分別為660 U/ml和5000 U/ml）、無菌小牛血清200 ml，充分混勻後，用無菌的10 ml吸管分裝於無菌的試管中，每管1 ml。血瓊脂平板：將市售血瓊脂基礎培養基加水後121 ℃15分鍾滅菌，待冷卻至50 ℃左右時，按10%加入新鮮的預溫至37 ℃的綿羊血，隨加隨混勻，再加入萬古黴素和多黏菌素B溶液，使其含量分別達到3.3 U、250 U/ml，混勻後傾注平板。巧克力色血瓊脂平板：製法基本同前，隻是在溫度降至80 ℃左右時加入綿羊血，繼續冷卻至50 ℃左右加入抗生素。A和C群腦膜炎奈瑟菌標準  菌種、脫脂牛奶（加萬古黴素和多黏菌素B）、滅菌生理鹽水。腦膜炎奈瑟菌標準診斷血清和生物梅裏埃膠乳凝集試劑：由國家疾病預防控製中心提供，有效期內使用。

    1.2   A和C群腦膜炎奈瑟菌懸液的製備   將A和C群腦膜炎奈瑟菌標準菌種接種於血瓊脂平板，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養18~24小時，括取菌苔，分別用生理鹽水、脫脂牛奶、小牛血清“雙抗”培養基製成懸液,使含量大約為102~106 CFU/ml。分類分裝於無菌試管中，每管6~8 ml。

    1.3   懸液中活菌含量的計數   將上述各種活菌懸液用無菌吸管各吸0.1 ml於平皿（×2）中，用小牛血清瓊脂傾注平板法計數活菌含量（37 ℃、5%CO2培養），作為冷凍試驗前的基數。冷凍試驗後，按規定時間，再吸出0.1 ml同法計數殘存的活菌數。

1.4   冷凍保存試驗   將上述各種計數後的活菌懸液置於4 ℃冰箱中（用水銀溫度計隨時檢測實際溫度），冷凍24、48、72、96、144、192小時（生理鹽水保存的菌種加測12小時結果），檢測仍存活的細菌數量。

    1.5  人群帶菌調查試驗   在0歲、1~2歲、3~4歲、5~6歲、7~14歲、15~20歲和20歲以上年齡組的人群中各選擇50人，每人用2根無菌棉簽同時在咽部采集咽拭子，將采好的咽拭子1根放入小牛血清“雙抗”培養基試管中（以下簡稱：新方法），帶回實驗室後再處理，另1根現場接種預溫的巧克力色血瓊脂平板（以下簡稱：常規方法），將平板保溫狀態下運到實驗室後置37 ℃、5%CO2培養箱中培養18~24小時。帶回實驗室的小牛血清“雙抗”培養基采樣管，用接種環挑取兩環，接種巧克力色血瓊脂平板（無需預溫），同上法培養，采樣管置普通的37 ℃培養箱中增菌12~18小時後挑取一接種環，接種巧克力色血瓊脂平板（無需預溫），置37 ℃、5%CO2培養箱中培養18~24小時。培養到期後，挑取可疑菌落進行形態學和血清學等鑒定。

    2   結      果

    2.1   冷凍保存效果   冷凍保存前，A、C群腦膜炎奈瑟菌的生理鹽水、脫脂牛奶、小牛血清“雙抗”培養基製成懸液活菌含量分別為：2.4×106 CFU /ml、4×106 CFU /ml；6×105  CFU /ml、6.5×105 CFU /ml；7×105 CFU /ml、8.4×105  CFU /ml。冷凍保存12小時後，生理鹽水中的A、C群腦膜炎奈瑟菌已檢不出有活菌存在。脫脂牛奶、小牛血清“雙抗”培養基的保存效果見表1。

    2.2   人群帶菌調查效果   本次共檢查了364人，其中0歲組49人，1~2歲組52人，3~4歲組50人，5~6歲組50人，7~14歲組52人，15~19歲組60人，20歲以上組51人。以上各年齡組的人應用常規方法均未檢出腦膜炎奈瑟菌；應用新方法，增菌前直接接種檢出1株B群腦膜炎奈瑟菌（該株菌在增菌後未能再檢出），增菌後檢出1株C群、2株B群和2株A群腦膜炎奈瑟菌，合計檢出了6株，檢出的菌株分布見表2。

    3   討      論

高分子量的有機物能夠提高微生物對不利的物理因素和化學消毒劑的抵抗力[3]。據此，我們設想用高濃度的小牛血清既作為腦膜炎奈瑟菌的保護劑，又為腦膜炎奈瑟菌提供更高的營養條件，這樣可使腦膜炎奈瑟菌在寒冷的環境中能夠被安全地帶回實驗室進行檢測。根據實驗結果，生理鹽水中的腦膜炎奈瑟菌，4 ℃12小時內全部死亡。從表1可看出，在小牛血清“雙抗”培養基或脫脂牛奶中，4 ℃24小時內，其活菌含量未見明顯下降（t=0.25, P>0.05），至96小時仍有一大部分細菌存活，說明小牛血清“雙抗”培養基或脫脂牛奶有很好的保菌效果。當活菌數下降至3~9 CFU/ml時，通過37 ℃培養18~24小時，可使活菌含量增加到(6~7)×107 CFU/ml，說明小牛血清“雙抗”培養基或脫脂牛奶均有很好的增菌作用。但也要注意腦膜炎奈瑟菌的自溶現象[3]，如表1中顯示的增菌後活菌數反而為“0”和1例樣本在增菌前檢出了B群腦膜炎奈瑟菌，而增菌後卻未能檢出，這一現象在我們的其它試驗中遇見的機率大約在5%~10%，因此，液體培養基中的腦膜炎奈瑟菌在增菌前應先接種一次固體平板培養基，以防自溶使活菌全部死亡而降低檢出率。人群帶菌檢查結果顯示，應用小牛血清“雙抗”培養基作采樣時的保菌劑和檢測時的增菌劑，有明顯的提高腦膜炎奈瑟菌檢出率的作用（χ2＝4.12, P<0.05）。上述結果說明了應用小牛血清“雙抗”培養基建立起的新的腦膜炎奈瑟菌檢測方法明顯優於常規的咽拭子直接接種法。

作者：王海燕，邵榮標，畢誠，鄭春早 

【參考文獻】
[1] 聞玉梅，主編. 現代醫學微生物學[M]. 上海：上海科學技術出版社，1999：258-259.
[2] 鹽城市疾病預防控製中心. 小牛血清“雙抗”培養基.中國:發明專利公報，200710019350.2[P]. 2007-08-08.
[3] 周正任,主編. 醫學微生物學[M]. 第6版.北京:人民衛生出版社,2003:108,152

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