三、用液體培養基分離純培養
對於大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數種類在固體培養基上長得很好。然而迄今為止並不是所有的微生物都能在固體培養基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來獲得純培養。
通常采用的液體培養基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經稀釋後的大多數試管中沒有微生物生長，那麽有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經稀釋後的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養物的機率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現為不生長。
四、單細胞（孢子）分離
稀釋法有一個重要缺點，它隻能分離出混雜微生物群體中占數量優勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。
對於較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，並在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的汙染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對於個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進行。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經適當稀釋後的樣品製備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取隻含一個細胞的液體來進行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限於高度專業化的科學研究中采用。
五、選擇培養分離
沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足自然界中一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。在一種培養基上接種多種微生物，隻有能生長的才生長，其它被抑製。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設計一套特定環境使之特別適合這種微生物的生長，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能隻占少數。這種通過選擇培養進行微生物純培養分離的技術稱為選擇培養分離，是十分重要的，特別對於從自然界中分離、尋找有用的微生物。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數場合下微生物群落是由多種微生物組成的，因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數量在108時，必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數量僅為102~3，顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，采用選擇培養分離的方法。或抑製使大多數微生物不能生長，或造成有利於該菌生長的環境，經過一定時間培養後使該菌在群落中的數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養分離。
1. 利用選擇平板進行直接分離
主要根據待分離微生物的特點選擇不同的培養條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產生菌時，可以在培養基中添加牛奶或酪素製備培養基平板，微生物生長時若產生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質水解圈。通過菌株培養時產生的蛋白質水解圈對產酶菌株進行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進行培養；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表麵或裏麵滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開。可將微生物群落點種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反複進行，得到純培養物。
2. 富集培養
主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，製定特定的環境條件，使僅適應於該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方麵進行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養等等許多方麵。圖2-7描述了采用富集方法從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸（r-hydroxybenzyl acid）的微生物的實驗過程。首先配製以對羥基苯甲酸為唯一碳源的液體培養基並分裝於燒瓶中，滅菌後將少量的土壤樣品接種於該液體培養基中，培養一定時間，原來透明的培養液會變得渾濁，說明已有大量微生物生長。取少量上述培養液轉移至新鮮培養液中重新培養，該過程經數次重複後能利用對羥基苯甲酸的微生物的比例在培養物中將大大提高，將培養液塗布於以對羥基苯甲酸為唯一碳源的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對羥基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲酸的液體培養基中進行培養，其中大部分在含有對羥基苯甲酸的培養基中生長，而在沒有對羥基苯甲酸的培養基中表現為沒有生長，說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目標微生物。通過富集培養使原本在自然環境中占少數的微生物的數量大大提高後，可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到純培養物。
富集培養是微生物學家最強有力的技術手段之一。營養和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應用於從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養方法提供了按照意願從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段，隻要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養法也可用來分離培養出由科學家設計的特定環境中能生長的微生物，盡管我們並不知道什麽微生物能在這種特定的環境中生長。
六、二元培養物
分離的目的通常是要得到純培養。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難作到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。隻有一種微生物的培養物稱為純培養物，含有二種以上微生物的培養物稱為混合培養物，而如果培養物中隻含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關係的培養物稱為二元培養物。例如二元培養物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關係。對於這些生物，二元培養物是在實驗室控製條件下可能達到的最接近於純培養的培養方法。
在自然環境中，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養，培養物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。對這些生物，二者的關係可能並不是嚴格的。這些生物中有些能夠純培養，但是其營養要求往往極端複雜，製備純培養的培養基很困難、很費事。
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