流行性乙型腦炎病毒免疫

　7.免疫乙腦病毒產生堅強的持久免疫力，迄今沒有見到臨床病例在痊愈後第二 次感染發病 的報道。且如上述，乙腦病毒的抗原變異不顯著，尚未發現在免疫保護力方麵明顯不同 的型或亞型，這就為流行性乙型腦炎的特異性預防提供了良好的基礎。目前應用的乙腦 疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種。滅活疫苗的製造方法簡單，易於保存，而且安全，但 因注射劑量較大，而且經常需要重複注射，國內目前應用的動物乙腦疫苗以弱毒疫苗為 主，但人用乙腦疫苗主要是滅活疫苗。　

　(1) 滅活疫苗：1943年，美國Sabin創製鼠腦滅活疫苗。 我國和日本也生產過大批 鼠腦滅活疫苗，並對人群進行大規模的免疫注射。由於疫苗中的鼠腦組織經常引起過敏 反應，日本於1966年研究成功酒精和魚精蛋白純化疫苗。美國於1966年創製倉鼠腎組織 培養滅活疫苗,免疫效果較好，而且適於大量生產，故已幾乎全部取代了鼠腦滅活疫苗。 隻在不具備組織培養條件的少數地區，繼續沿用鼠腦滅活疫苗作動物的預防注射。　

　① 鼠腦滅活疫苗：采用免疫原性良好的強毒株，腦內通過8～12g小鼠， 使其最小 致死量提高至10-7/003ml(腦內)以上，作為種毒。製苗時，取種毒腦內接種小鼠 ，每隻003ml。逐日觀察，一般於接種後第3～4天出現症狀，挑選症狀明顯和瀕死的小鼠 ，斷頸或心髒放血後無菌采腦，置於內盛玻珠的厚壁玻瓶或於電動組織搗碎器內充分乳化 ，並補加pH78～80的磷酸鹽緩衝鹽水，作成10%懸液。再置2 000r/min的離心機內 離心沉澱20分鍾，吸取上層液，加入10%福爾馬林，使其最後濃度為02%。置4℃冰箱內， 每天充分振蕩一次，滅活21天。再用pH78～80的磷酸鹽緩衝鹽水稀釋1倍， 使鼠腦的 最後濃度為5%，福爾馬林的最後濃度為01%。作者所在的實驗室曾用這個方法製造乙腦 滅活疫苗,在用小鼠作效力測定時免疫指數(保護指數)高達20萬以上。這種疫苗用於 馬騾時，每次皮下注射5ml，間隔7～10天後再作第2次注射。 一般可使接種馬騾安全渡 過一個乙腦流行期。據幾個地區的應用結果來看，注射鼠腦滅活疫苗後可將發病率降低 至1/3～1/5。製造酒精魚精蛋白純化疫苗時，先將發病鼠腦作成20%懸液，以3 500r/min的速度 於4℃離心沉澱30分鍾，棄沉澱，吸取上層液，加入等量4℃的40%酒精，置10～15℃3小時 ，再以3  500r/min的速度離心沉澱30分鍾，棄上層液，取沉澱物，加入4℃　PBS， 作成40 %懸液，再以3 500r/min的速度於4℃離心沉澱30分鍾，棄沉澱，吸取上層液，加入等量 4℃　PBS，並按每ml 2～3mg的量加入硫酸魚精蛋白，置4℃感作30分鍾後，以3 500r/mi n的速度於4℃離心沉澱30分鍾，棄沉澱物，吸取上層液，加入福爾馬林和硫柳汞，使其 最後濃度為01%和001%。再作適當稀釋，並加入005%吐溫80即成。　

　② 雞胚滅活疫苗：先使種毒通過雞胚幾代，待其完全適應於雞胚內增殖後應用。 將 雞胚適應毒作1∶100～1∶1 000稀釋後，接種於8日齡雞胚的卵黃囊內，於35～36℃溫箱中 繼續孵育64～68小時後收獲胚體，去頭及爪，加入pH78～80的磷酸鹽緩衝鹽水，於組 織搗碎器內作成20%懸液，以2 000r/min的速度於4℃滅活處理21天，經無菌、安全和效 力檢驗後應用。馬騾每次皮下注射10ml，間隔7～10天後再作第2次注射。由於雞胚苗的 免疫效果較差，用量大，保存期短，多次注射後曾見少數馬匹發生過敏反應，目前已少用.

③ 倉鼠腎組織培養滅活疫苗：接種強毒於倉鼠腎組織培養細胞內， 約於接毒後30～40 小時，在出現“++”的細胞病變時收獲，加入01%～02%福爾馬林作滅活處理，即為滅 活疫苗。為了提高疫苗產量，生物製品單位目前通用轉瓶培養法，即在10 000～15 000 ml的大轉瓶內，接常規方法培養倉鼠腎細胞，以內含5%犢牛血清的02%乳白蛋白水解物 作為營養液，轉瓶培養。待其長成單層後，以Earle液衝洗多次， 除去殘留的血清蛋 白，隨後換入內含007%半胱氨酸和01%人白蛋白的Earle液作維持液。維持液中含有 10-5濃度的強毒鼠腦。每瓶加入量為3 000ml。37℃培養28小時，鏡檢發現開始有細胞 病 變時即可收毒——吸取上層液。毒力效價一般可達10-6個小鼠MLD。加入005%福爾 馬林和0005%硫柳汞，置22℃滅活8天即成。在殘留有細胞的大轉瓶內，再行加入3 000ml 維持液，繼續培養17～20小時，有時還可獲得10-5～10-6效價的病毒液。　　

(2)　弱毒疫苗：我國病毒學工作者在乙腦病毒的減毒和弱毒株的培育方麵，做了大量 工作，並已取得可喜成果。先後育成許多弱毒疫苗株，其中某些株已經做過大量人群或 動物的免疫試驗。美國和日本也曾育成幾個弱毒株，例如美國應用倉鼠腎組織培養細胞 進行繼代減毒，獲得OCT541株，再經雞胚細胞和雞腦細胞傳代，育成高度減毒株。 日 本也用倉鼠腎細胞傳代的方法獲得幾個弱毒株。

①　53株：係我國乙腦強毒SA14株經馴化篩選後獲得的弱毒疫苗株。SA14株 在連續通 過倉鼠腎原代細胞20代後，毒力發生顯著變化，其對小鼠的腦內毒力已由10-5～10 -6下降至10-1～1025/003ml。經蝕斑純化後育成1217號蝕斑株，繼續 傳代減 毒、 純 化，又選出1株蝕斑毒，即97株,再經傳代篩選，育成53株。用此株給3周齡小鼠作皮 下注射，病毒不能入腦，但對25周齡以下的小鼠，還有一定的入腦能力。 皮下或腦 內注射1～3日齡乳鼠，均有致病力。腦內及皮下注射時的致死毒力(LD50)分別為3 0 對數以下和20對數以下。曾經試用於40多萬兒童的接種試驗，證明安全， 並有較好的免 疫效果，人群保護率達80～90%，抗體陽轉率為85～91%。將53株或97株試用於馬匹和 豬的免疫接種，也獲較好效果。目前通用的是其倉鼠腎組織培養弱毒疫苗。　　由於53株和97株在小鼠腦內連續傳3～5代後，殘餘毒力並不明顯回升。某些地 區試用此株接種(腦內)乳鼠，待其發病後，采腦作成10%懸液， 直接供馬騾或豬的 現場應用，收到較好效果。

　　②　28株：係將上述1217株經紫外線進一步減毒，再經乳鼠皮下傳代，提高其皮 下增殖力和免疫原性而育成的弱毒疫苗株。此株在給乳鼠作腦內注射時，死亡率為75%，  皮下注射時引起50%的死亡率。3周齡小鼠在腦內注射時基本上不死亡，皮下注射後病 毒不能入腦。經乳鼠腦內連續傳代，毒力回升不明顯。給小鼠作一次皮下免疫注射， 保護力可達70對數以上。大規模的馬群免疫試驗(13萬餘匹)證明安全。免疫後1個月， 中和抗體的陽轉率達85%左右。流行病學調查證明，疫苗注射組的發病率為23/10萬，而 未注射對照組的發病率為1721/10萬，保護率為867%。目前通用倉鼠腎細胞培養疫苗。 試用28株接種小鼠，待其發病後采腦製苗，注射馬騾和豬，也取得良好的免疫效果。　　曾用鼠腦和倉鼠腎培養的28株給4萬多匹馬進行免疫注射， 僅極少數發生輕度局部 腫脹、低燒和食欲減退，未見其它不良反應。　　敖堅等應用另一弱毒蝕斑株——142株在BHK21細胞上製造弱毒疫苗。用 以給妊娠母豬進行免疫注射，未見不良反應。接種後的中和抗體陽轉率為80%～100%，死 產率顯著下降。　　在上述弱毒疫苗株的基礎上，又曾育成一些新的弱毒株，例如將53株通過雞胚、  倉鼠腎細胞交替傳代3次， 再在雞胚細胞上挑斑( 蝕斑)， 育成所謂的雞53株等等。  由於液體活疫苗在4℃的有效期僅2～3個月， 而凍幹保存時又易在幹燥過程中使疫苗效價下 降，因此必須積極研究弱毒疫苗的保存方法，以利推廣應用。　　幼畜可由初乳獲得被動免疫——母源抗體。具有被動免疫的幼畜，在用弱毒疫苗接種 後不易產生主動免疫。為保證有效免疫力的產生，活疫苗接種應在幼駒出生後2～4個月進 行，幼豬也應在出生後2個月以上開始接種。　　日本曾用井上等育成的減毒M株於豬的預防接種。