幽門螺杆菌改良無血培養基的研製

   An improved medium without blood for Helicobacter pylori

    WANG Yichao,GUO Gang,XIE Qinghua,ZOU Quanming(Department of Clinical Microbiology,Third Military Medical University,Chongqing 400038)

    Abstract Establish a rapid and easy medium without blood for Helicobacter pylori.Improve the components to the brain heart infussion-egg yolk agar medium without blood(BHI-EA).Through isolation and cultivation of the Helicobacter pylori from 82 stomach mucosas with the improved medium and brain heart infusion agar containing blood(BHIA)to compared the difference between this improved medium and BHIA on the positive rate of the stomach mucosas,isolation time and grow speed of pure cultivation.The rate of Helicobacter pylori positive with the improved mediums was 70%(57/82),but with the BHIA was 63%(52/82).The time for pure cultivation could shorten 12 h,isolation shorten 24 h.All the test indexes were typically.The improved medium is easier to isolate and culture Helicobacter pylori.

    Key words Helicobacter pylori； Medium

    Helicobacter pylori(幽門螺杆菌,Hp)是一種與人類消化道疾病密切相關的病原菌。其體外培養的方法較多［1，3］，國內多采用含血腦心浸液培養基。由於其操作的繁瑣及易汙染性，近年來陸續有人采用無血培養基即卵黃培養基［4，5］，但該培養基仍存在培養時間較長的缺點。針對此情況，我們在卵黃培養基的基礎上進行改良，使培養時間縮短，且細菌的各種生物學性狀均較典型。

    1 材料及方法

    1.1 培養基的製備

    1.1.1 含血腦心浸液培養基(BHIA) 取腦心浸液(BHI)［6］45 ml加入蛋白腖1 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸餾水 55 ml，調節pH值至7.6～7.8，加瓊脂粉1.5 g後高壓，再加入已滅菌綿羊血5 ml，10 g/dl葡萄糖5 ml和萬古黴素、磺胺增效劑(TMP)以及多粘菌素B，使其最終濃度分別達到10 mg/L、5 mg/L、0.38 mg/L，倒平板備用。

    1.1.2 卵黃腦心浸液培養基(BHI-EA) 取新鮮雞蛋於75%酒精內消毒10分鍾，以無菌手續將卵黃取出放入有玻璃珠的無菌生理鹽水中，使最終體積比為1∶1，搖勻備用。向45 ml牛腦心浸液中加入胰蛋白腖1 g，1 g/dl可溶性澱粉，NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸餾水55 ml，調節pH值為7.6，加瓊脂粉1.5 g高壓，待溫度降至60°C時加入上述卵黃水30 ml，再加入20 g/dl無菌葡萄糖溶液3 ml及抗生素混懸液，使最終濃度分別為，萬古黴素10 mg/L，TMP 5 mg/L，多粘菌素B 0.38 mg/L，倒平板待用。

    1.2 Hp分離培養 取82例我校附屬醫院消化科胃鏡室就診病人胃粘膜標本，分別置玻璃勻漿器內研磨後，取等量懸液均勻塗布於上述二種培養基上。將各接種平板置於密閉玻璃幹燥器內，用抽氣泵抽至負壓73 kPa後，灌入氣體使終濃度分別達到(5% O2、85% N2、10% CO2)，罐內放一盛水小瓶，使濕度＞95%，37°C孵箱內孵育1～4天，觀察Hp生長情況以及檢測生物學性狀。

    1.3 Hp純培養 取等量已分離純化的Hp菌液轉種到上述兩種培養基上，L型玻璃棒均勻塗布後培養，培養條件同上，觀察長出肉眼可見菌落所需時間。

    1.4 Hp鑒定 生長出的菌株用革蘭染色鏡檢，PCR鑒定，另作脲酶、氧化酶、觸酶及動力實驗對其生物學性狀進行檢測，步驟按常規法進行。

    2 結果

    2.1 兩種培養基上胃標本中Hp分離培養速度的比較標本接種後，每24小時觀察一次，如出現可疑Hp菌落，則取菌塗片行革蘭染色鏡檢，並作脲酶、氧化酶、觸酶和PCR鑒定。如果形態染色典型，脲酶、氧化酶、觸酶及PCR陽性則確認為標本Hp分離陽性。用BHI-EA培養基培養24小時後陽性例數在總陽性例數中的比率為21%(12/57)，高於BHIA上24 h的陽性比率2%(1/52)，兩者相差顯著(P＜0.01)。培養48 h後BHI-EA上的陽性比率為88%(50/57)，也顯著高於BHIA上的陽性比率60%(31/52)(見表1)，證明BHI-EA培養基能顯著縮短胃標本中Hp的檢出時間。

   表1 兩種培養基上不同時間胃粘膜標本分離Hp的陽性例數

    2.2 兩種培養基上胃標本Hp分離陽性率比較分別對82例不同胃病患者(胃癌9例，胃炎16例，胃潰瘍23例，十二脂腸潰瘍24例，其它胃疾病10例)胃粘膜標本進行分離培養。結果在BHIA上陽性分離率為63%(52/82)，而在BHI-EA上陽性率為70%(57/82)。培養結果表明，BHIA與BHI-EA對不同消化道疾病患者胃粘膜的Hp分離陽性率基本一致，BHI-EA稍高於BHIA，無統計學差異(P＞0.05)。

    2.3 兩種培養基上Hp純培養生長速度的比較所有Hp分離株在此兩種培養基上均能順利生長，但生長速度明顯不同，分別取前述57例陽性標本的分離菌株進行純培養。在BHI-EA上12 h即有4株菌長出肉眼可見菌落，24 h內陽性結果為41例，陽性率為72%(41/57)。而BHIA上12 h內無明顯菌落出現，直到24 h才有8株菌株出現，陽性率僅為14%(8/57)，顯著低於BHI-EA組(P＜0.01)。

    3 討論

    最近幾年報道的針對Hp培養的無血培養基基本解決了應用含血培養基易汙染的問題。但其培養速度仍較慢，我們采用的改良無血培養基充分解決了這一問題，在此培養基中，我們加入了相當於常規卵黃培養基中兩倍的卵黃量，同時加入適量的胰蛋白腖成份，充分滿足Hp生長營養需求，有效地刺激其生長，此外加入可溶性澱粉可吸附標本中有毒物質及Hp生長的代謝產物，保證Hp處於有利的生長環境。由實驗結果可以得出，改良卵黃培養基能大大提高Hp的生長速度從而較大程度的節省培養時間，而且各項生物學性狀均很典型，完全能滿足臨床診斷及Hp的研究所需，是一種實用的Hp培養方法。

    幽門螺杆菌作為人胃內定居菌，對營養成分、氣體條件等均有較嚴格的要求，使其在體外培養中受到很多因素的影響，因此培養基在製備過程中應嚴格控製pH值和各種成份的含量，特別是抗生素濃度及葡萄糖的含量。此外，由於Hp生長需要一定濕度條件，故在培養基傾倒平板後，應密封放4°C冰箱待用，放置時間不宜超過兩周，保證Hp在新鮮培養基中有一最佳生長環境。另外，由於此培養基能有效的促進Hp生長，故在培養過程中應掌握好時間以防生長過度導致細菌球性變。

    參考文獻

    1 Sahay P,West A P,Hawkey P M,et al.Isolation of Helicobacter pylori from faeces.J Infect,1995,30:262～263

    2 Ferguson D A J,Li C,Patel N R,et al.Isolation of Helicobacter pylori from saliva.J Clin Microbiol,1993,31:2802～2804

    3 Hirata I,Itoh T,Masubuchi N，et al.Isoaltion identification and quantitative culture of Helicobacter pylori from gastric mucosa.Nippon Rinsho,1993,51:3170～3175

    4 牟兆欽，尹秀雲，李富裕，等.用無血腦心浸液卵黃瓊脂培養基分離培養幽門螺杆菌的研究.軍事醫學科學院院刊，1995,19(1):63

    5 吳開宇，吳平，潘秀珍，等.一種用於幽門螺杆菌培養和菌種保存的培養基――卵黃培養基.微生物學通報，1992，19(2):112

    6 周殿元，等主編.幽門螺杆菌感染的基礎與臨床.北京：中國科技出版社，1997.290

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