1 範圍
本標準規定了水產品中創傷弧菌( Vibrio vulnificus )的檢驗方法。
本標準適用於魚、蝦、蟹、貝類等水產品中創傷弧菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 恒溫培養箱:36士1℃。
2.2 冰箱:2-5℃.7-10℃。
2.3 恒溫水浴鍋。
2.4 均質器或無菌研缽。
2.5 天平:感量0.1 g。
2.6 PCR儀。
2.7 電泳儀或毛細管電泳儀。
2.8 凝膠電泳成像係統或紫外檢測儀。
2.9 生物安全櫃。
2.10 高速離心機(最大轉速至少15000r/min)。
2.11 渦旋振蕩器。
2.12 微量可調移液器(量程2.5μL.10μL、100μL、1000μL)及配套吸頭。
2.13 精密pH試紙或pH計。
2.14 無菌試管:規格18mmX180mm和15 mmX 100 mm。
2.15 無菌吸管:規格1 mL(具0.01ml刻度)和10mL(具0.1mL刻度)。
2.16 無菌錐形瓶:容量250mL、500ml和1000ml。
2.17 無菌培養皿:直徑90 mm。
2.18 無菌手術剪、鑷子、鉗子等。
2.19 PCR反應管。
3 培養基和試劑
3.1 蛋白腖-氯化鈉-纖維二糖-多黏菌素E(PNCC)增菌液。
3.2 纖維二糖-多黏菌素E(CC)瓊脂培養基。
3.3 改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E(mCPC)瓊脂培養基。
3.4 3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂培養基。
3.5 磷酸鹽緩衝液(PBS)。
3.6 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵。
3.7 嗜鹽性試驗培養基。
3.8 3%氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養。
3.9 3%氯化鈉MR-VP培養基。
3.10 3%氯化鈉溶液。
3.11 氧化酶試劑。
3.12 革蘭氏染色液。
3.13 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)試劑。
3.14 Voges-Proskauer(V-P)試劑。
3.15 細菌DNA提取試劑盒。
3.16 生化鑒定試劑盒。
3.17 PCR反應配套試劑。
3.18 瓊脂糖凝膠電泳配套試劑。
3.19 具有菌種保藏資質單位提供的創傷弧菌標準菌株。
4 檢驗程序
創傷弧菌檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 樣品製備
5.1.1 新鮮樣品采集後應於3h內完成檢驗,若不能在規定時間內完成,則將樣品置於7℃-10℃條件下保存(因創傷弧菌在4℃條件下極易形成活而不可培養的狀態,因此樣品勿放4℃條件下),並盡可能在24h內完成檢驗;冷凍樣品應在不超過45℃的溫熱條件下解凍，解凍時間不超過15min。
5.1.2 取樣:魚類和頭足類取其表麵組織、腸和鰓。貝類則取全部內容物(包括貝肉和體液)。甲殼類取整個動物或其中心部分(包括腸和鰓)。如為帶殼貝類或硬殼甲殼類,則應先用流動自來水衝洗外殼並用濾紙吸幹表麵水分,然後無菌操作打開外殼,按上述要求取相應部分。
5.1.3 以無菌操作取上述處理後的樣品25 g,加人PNCC增菌液225 mL,用旋轉刀片式均質器以8000 r/ min均質1 min,或用拍擊式均質器均質2 min,充分混勻製備成1 : 10的樣品勻液。如無均質器,則將樣品放人無菌乳缽中充分研磨,取磨碎後的樣品25 g轉人500 ml無菌錐形瓶中,加入PNCC增菌液225 mL,充分振蕩混勻,製備成1 : 10的樣品勻液。
5.2 增菌將5.1.3製備的1 : 10樣品勻液於36士1℃培養18h士1h。
5.3 PCR檢測
PCR實驗環境條件和過程控製應參照GB/T 27403《實驗室質量控製規範食品分子生物學檢測》規定執行,下同。
5.3.1 DNA模板的製備
在距離PNCC增菌液的液麵下1 cm處吸取1 mL置於1.5 mL EP管中,9000r/min離心3 min,棄去上清液。向沉澱中加入1 ml PBS將其懸浮並充分清洗後,9000r/min離心3 min,棄去上清液，按此步驟反複清洗沉澱2次～3次,棄去最後一遍上清液,加入1 ml無菌超純水,100℃煮沸10 min,繼而12000r/min離心5min,上清液用於PCR分析。若不能及時分析則於一20C保存備用。也可以用商品化的DNA提取試劑盒按其說明書要求提取製備DNA模板。
5.3.2 PCR擴增
5.3.2.1 引物
信息見表1。
5.3.2.2 對照設置
每次PCR反應使用創傷弧菌標準菌株作為陽性對照,同時,使用除創傷弧菌之外的其他弧菌的標準菌株作為陰性對照,以滅菌去離子水作為空白對照。
5.3.2.3 PCR反應體係
見表2。
5.3.2.4 PCR反應程序
預變性:94℃、5min;變性:94℃、1min;退火:62℃、1min;延伸:72℃、1min;循環數:30;終延伸:72℃、10 min;電泳檢測。若不能立即檢測則4℃保存備用。
5.3.3 電泳
凝膠電泳檢測PCR擴增產物。用0.5 X TBE緩衝液配製1.5%的瓊脂糖凝膠(含EB 0.5 rg/mL或Goldview 5 μL/100 ml或Gelred 5 μL/50 ml等DNA染料),取5 μL. PCR擴增產物與1 μl. 6X核酸電泳上樣緩衝液混合後,點樣,同時有一孔加入DNA分子量標準(範圍為100 bp～1000 bp)。根據以下公式:電泳槽正負極的距離(cm)X5V/em計算並設置電壓,使用0.5XTBE緩衝液恒壓電泳,根據溴酚藍的移動位置確定電泳時間,使用凝膠成像係統或紫外檢測儀觀察和記錄結果。
5.3.4 結果判定
質控係統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽性對照出現預期大小(519 bp)的擴增條帶，則檢測係統正常。否則,任-種對照如果出現非上述正常結果,應重做實驗,同時排除汙染因素。
陽性結果:在質控係統正常的情況下,待測樣品出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陽性。
陰性結果:在質控係統正常的情況下,待測樣品未出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陰性。
5.4 分離
用10 μL接種環在距離PNCC增菌液的液麵下1 cm沾取- -環增菌液,分別劃線接種於CC和mCPC平板,於36℃士1℃條件下培養18 h士1h。典型的創傷弧菌在CC和mCPC平板上的形態為:圓形、扁平,光照下呈透明或中心不透明但邊緣透明的黃色至橘黃色菌落,菌落直徑1mm～2mm,菌落周圍可出現(或不出現)黃色暈圈。
5.5 分純培養
從CC平板和mCPC平板上各挑取至少5個創傷弧菌可疑菌落(少於5個時全選),分別接種於3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板,36℃士1℃培養18h士1h後用於後續鑒定。創傷弧菌在3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板.上的菌落形態為圓形、乳白色、濕潤、隆起、直徑1 mm～2mm。
5.6 鑒定
創傷弧菌可采用菌落特征結合生化特性或PCR方法進行鑒定。
5.6.1 菌落特征及生化特性
5.6.1.1 初步鑒定
該步驟用於創傷弧菌的初步鑒定,進行以下4項鑒定實驗時,挑取的菌落應來自分純後的同一個單菌落。
a)革蘭氏染色鏡檢:從5.5中3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落進行革蘭氏染色並鏡檢。創傷弧菌為革蘭氏陰性,顯微鏡下菌體為棒狀、弧狀、卵圓狀等多種形態,無芽胞。
b)氧化酶試驗:用接種環從5.5中3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落適量,塗布在用氧化酶試劑潤濕(如無菌濾紙)或滴有氧化酶試劑的白色或無色載體上(如載玻片)。如果塗菌部位在10 s之內變紫色(偶有藍紫色),即為氧化酶試驗陽性,不變色為氧化酶試驗陰性。創傷弧菌為氧化酶試驗陽性。
c)三糖鐵試驗:用接種針從5.5中3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落適量,轉種於3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵並穿刺底層(注意接種針不要觸及試管底部),36℃士1℃培養24h觀察結果。創傷弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵中生長時試管底層變黃,無氣泡,斜麵顏色不變黃(偶有斜麵顏色變黃現象)。
d)嗜鹽性試驗:用接種針從5.5中3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落，分別接種於含0%、3% .6%、8%和10%氯化鈉的胰蛋白腖水中,36℃士1℃培養24h,觀察液體的混濁情況。創傷弧菌在含0% .8%和10%氯化鈉的胰蛋白腖水中不生長或微弱生長,胰蛋白腖水澄清透亮或稍混濁.而在含3%和6%氯化鈉的胰蛋白腖水中生長旺盛,胰蛋白腖水混濁。
5.6.1.2 確證實驗
將初步鑒定為創傷弧菌的疑似菌落接種在3%氣化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上,36℃士1℃培養18h士1h後,取純培養物分別接種於含3%氯化鈉的賴氨酸脫羧酶試驗培養基和MR-VP培養基中，36℃士1 ℃培養24 h～48 h後觀察結果;另取少許純培養物接種於3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵，36℃士1℃培養18h後用於ONPG試驗。也可選擇生化鑒定試劑盒進行鑒定。
創傷弧菌生化特性見表3,與其他弧菌的鑒別見表4。
5.6.2 PCR鑒定
本部分試驗可替代5.6.1用於創傷弧菌的快速鑒定。
5.6.2.1 DNA模板的製備
從5.5中3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板.上挑取創傷弧菌疑似菌落,轉至500 μL無菌超純水中，充分混勻後製成肉眼可見的混濁菌懸液,煮10min,12000r/min離心5min,取上清液用於PCR分析。若不能及時分析則於一20℃保存備用。也可以用商業化的DNA提取試劑盒按其說明提取製備DNA模板。
5.6.2.2 PCR擴增和電泳
同5.3.2和5.3.3。
5.6.2.3 結果判定
質控係統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽性對照出現預期大小(519 bp)的擴增條帶，則檢測係統正常。否則,任一-種對照如果出現非_上述正常結果,應重做實驗，同時排除汙染因素。
陽性結果:在質控係統正常的情況下,待測樣品出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陽性，該菌株是創傷弧菌。
陰性結果:在質控係統正常的情況下,待測樣品未出現預期大小(519bp)的擴增條帶,判定PCR結果為陰性,該菌株不是創傷弧菌。
5.7 創傷弧菌分型(選做)
5.7.1 DNA模板的製備
取鑒定結果為創傷弧菌的菌株製備DNA模板,製備方法同5.6.2.1。
5.7.2 PCR擴增
5.7.2.1 引物
PCR分型用引物信息見表5。
5.7.2.2 對照設置
每次PCR反應使用含有目的基因的創傷弧菌標準菌株作為陽性對照，同時,使用除創傷弧菌之外的其他革蘭氏陰性菌標準菌株作為陰性對照,以滅菌去離子水作為空白對照。
5.7.2.3 PCR反應體係.
同表2。
5.7.2.4 PCR反應程序
預變性:94℃、5min;變性:94℃.1min;退火:55℃(vcg基因)、58℃ (16S rRNA基因)、64℃(Bt2基因及SerE基因)1min;延伸:72℃.1min;循環數:30個循環(vcg基因及16S rRNA基因)、
35個循環(Bt2基因及SerE基因);終延伸:72℃、5 min;電泳。若不能及時電泳檢測,則將擴增產物於4℃短期(1 d～2 d)儲存。
5.7.3 電泳
同5.3.3。
5.7.4 結果判定
質控係統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽性對照出現預期大小的擴增條帶,則檢測係統正常。否則,任--種對照如果出現非上述正常結果,應重做實驗,同時排除汙染因素。在質控係統正常的情況下,如果待測菌株出現97 bp大小的條帶,則判定該株創傷弧菌為vcg℃型;如果出現199 bp大小的條帶,則判定該株創傷弧菌為vcg E型;
如果待測菌株出現285bp大小的條帶,則判定該株創傷弧菌為16SrRNAA型,如果出現839bp大小的條帶,則判定該株創傷弧菌為16SrRNAB型,如果同時出現285bp大小和839bp大小的兩條帶,則判定該株創傷弧菌為16SrRNAA/B型;
如果待測菌株出現665 bp大小的條帶,則判定該株創傷弧菌為血清E型;如果待測菌株出現344 bp大小的條帶.則判定該株創傷弧菌為生物1I型。
6 結果與報告
根據菌落特征、生化特性或PCR鑒定結果,報告25g樣品中檢出或未檢出創傷弧菌。
附：GB4789.44-2020 創傷弧菌檢驗標準 點擊下載
附：GB4789.44 創傷弧菌檢測用培養基核算表 點擊下載
蛋白腖-氯化鈉-纖維二糖
-多粘菌素E（PNCC）增菌液
GB4789.44 創傷弧菌檢測用培養基核算表
用途
貨號
名稱
規格
稱量數
需求
每瓶/盒/包可做配製
單價
前增菌
HB9174
250g
60g/升
每個樣品225ml
每瓶可倒18個樣
120
添加劑
HB9174a
PNCC添加劑
4.5ml*10支
220.5ml裏加一支
每250g需配2盒
150
或即用型
HBJ019
225ml*10袋
無需另外加入添加劑
200
分離
HB4151
MCPC培養基
250g
50.08g/900ml
每個平板20ml
每瓶可倒224個平板
120
添加劑
HB4151a
MCPC添加劑
1ml*5
100ml加入1支，每250g需10盒
每盒可倒25個平板
80
HB4151b
10%纖維二糖
5ml*10
100ml加入2支，每250g需10盒
每盒可倒25個平板
210
或即用型
HBPM4151
MCPC培養基平板
9ml*10
每個樣品需1個平板
200
分離
HB4151-2
纖維二糖-多粘菌素E瓊脂
250g
50.08g每升
每個平板20ml
每盒可倒140個平板
120
添加劑
HB4151-1a
CC瓊脂添加劑
1ml*5
100ml加入1支，每250g需10盒
每盒可倒25個平板
40
HB4151b
10%纖維二糖
5ml*10
100ml加入2支，每250g需10盒
每盒可倒25個平板
210
純化
HB8631
3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂
250g
65g每升
每個平板20ml
每盒可倒190個平板
95
或即用型
HBPM8631-1
3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板
9ml*10
每個疑似菌接種一個平板
每包10個平板
70
穿刺試驗
HB4088-3
3%氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂
250g
89.5g/升
每個斜麵5ml
每瓶可做270-400個斜麵
90
或即用型
HBPT008-1
3%氯化鈉三糖鐵管
20支
160
生化
HBIG10
HBI創傷弧菌成生化鑒定條
5條/盒
每盒可接5個菌
175
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