在進行培養基的驗收，檢驗培養基的靈敏度、生長率時，都需要用到定量菌株。細菌的個體很小，肉眼無法直接看到，我們所看到的培養基平板上的菌落、渾濁的液體培養基，都是數以億計的細菌集合體。在初次進行低濃度定量菌株菌懸液（10-100CFU/mL或20-200CFU/mL）製作時，通常使用十倍或百倍稀釋法進行製作。
下麵就為大家介紹十倍稀釋法的具體操作步驟：
1、將生理鹽水（或磷酸鹽緩衝液等）分裝至試管中，每支裝量為9mL（百倍稀釋可用10mL，特殊情況也可使用9mL做近似百倍稀釋），進行滅菌處理（121℃滅菌15-30min即可）；
注：在進行厭氧菌（如生孢梭菌，產氣莢膜梭菌）稀釋時，選用0.1%蛋白腖水或pH7.0氯化鈉蛋白腖緩衝液做為稀釋劑效果更佳；若不在厭氧環境中操作，從開始稀釋至使用菌懸液結束要控製在15min以內，時間過長會導致菌體死亡。
2、將滅菌後裝有9mL生理鹽水的試管編號1，2，3，4，5，6，7，8。
3、將一定量的菌加入至編號1的試管中製成第一稀釋梯度菌懸液（通常稱為10-1梯度），使用旋渦振蕩器混勻。
4、吸取1mL10-1梯度菌懸液至編號2的試管中，混合均勻，就得到了第二稀釋度的菌懸液（通常稱為10-2梯度，若吸取10-1梯度菌懸液100μL至10mL生理鹽水管中，即為百倍稀釋，可以直接得到10-3梯度菌懸液）。
5、以此類推，可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度菌懸液，每一支管的含菌量都是前一直管的1/10，第8支管的菌液濃度就是第1支管的千萬分之一了，如果第一支試管含菌量是109CFU/mL，第8支管就可以得到100CFU/mL左右濃度的菌懸液了。
現在稀釋方法有了，那麽如何製備第一支試管的菌懸液及確定第一支試管中菌液的濃度呢？一般采用以下四種方法：
1.麥氏比濁法
將一定量培養好的細菌轉移到第一支試管中（可以用菌液，可以挑取菌落），製備成約5麥氏濁度的均一渾濁的菌懸液（約109CFU/mL），稀釋即可。
優點：新手可直接上手操作
缺點：不同細菌體積大小有差別，有些芽孢菌容易聚成團塊不易製得均一懸液；不適用於真菌孢子懸液製備；
注意事項：不同細菌的麥氏濁度與濃度之間存在差異，第一次試驗之前最好先進行驗證；麥氏濁度無法區分細菌死活，因此最好使用新活化的菌製備；真菌（酵母菌）體積較大，同等濁度下濃度約為細菌的1/20。
2、吸光度法
細菌在600nm波長處具有最大吸光度，在一定濃度下，細菌的濃度與OD600nm呈正比關係，因此可以通過測量OD600nm值來確定菌懸液濃度。此方法更常用於測定菌液濃度（觀察細菌生長曲線），也可在製備105-107CFU/mL的菌懸液時使用，不適用於低濃度菌懸液製備。
3、菌液稀釋法
將菌株接種至非選擇性肉湯培養基中過夜培養，吸取1mL培養物至9mL生理鹽水中製成10-1梯度菌懸液（約108CFU/mL），稀釋至10-6或10-7即可得到10-100CFU/mL菌懸液。
優點：操作簡單
缺點：菌數不穩定，受細菌種類、培養基影響較大；僅適合均勻渾濁生長的細菌或真菌；若培養過程發生汙染，不易察覺。
注意事項：不同菌株生長時間不同，在不同培養基中生長濁度也不同，如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄菌、沙門氏菌等在TSB中過夜培養即可，乳酸菌通常需在MRS肉湯中培養48-72h，酵母菌、白色念珠菌需在SDB培養基中培養3-5天。酵母菌、芽孢菌通常在10-5稀釋度左右，就可以得到10-100CFU/mL的菌懸液。
4、菌苔稀釋法
從平板或斜麵上挑取一定量的菌苔（2-3mm單個菌落，菌落偏小可多挑幾個菌落）至9mL生理鹽水中振蕩均勻，製成10-1梯度菌懸液（約108CFU/mL），稀釋至10-7或10-8即可得到10-100CFU/mL菌懸液。
優點：操作簡單，相比較於其他稀釋方法，最大優勢就是更容易準確控製菌數濃度；適用範圍廣，細菌、真菌均可采用此方法製備菌懸液。
缺點：需要嚐試和經驗
注意事項：不同菌株製成的菌懸液濃度同樣存在差異，初次進行特定菌株稀釋時需要做驗證；一般非芽孢細菌製成的10-1梯度菌懸液約為108-109CFU/mL，而芽孢菌和酵母菌製成的10-1梯度菌懸液約為106-107CFU/mL。
5、總結：
初次進行菌液製備時，可以選用方法1和方法4，多做幾個稀釋度測試，熟練有經驗後使用方法4進行菌液製備，可輕鬆準確製得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL濃度菌懸液。
製備好的菌懸液可在驗證過的時間內使用，使用時間一般與稀釋劑有關，接下來我們再來講一下稀釋劑的選擇和應用：
1、0.85%生理鹽水或0.9%氯化鈉溶液：
在國標中通常使用0.85%生理鹽水，中國藥典中常使用0.9%氯化鈉溶液，二者效果無明顯差別，可適用於絕大多數細菌或真菌的菌懸液或孢子懸液製作（孢子懸液較穩定一般可在2-8℃存放一個月或者更長時間）。
2、磷酸鹽緩衝液：
與生理鹽水效果接近，可用於菌懸液製備和稀釋，但更常用於樣品的稀釋。
3、0.1%蛋白腖水或pH7.0氯化鈉蛋白腖緩衝液：
相比較於生理鹽水，此兩種緩衝液對於產氣莢膜梭菌、生孢梭菌等厭氧菌的效果更好，更能保持細菌的活性。該培養基因含有少量蛋白腖，細菌易發生繁殖導致菌數發生變化，通常製備的菌懸液需在短時間內使用（一般細菌建議在45min內使用，厭氧菌建議在15min內使用）。
上述的方法主要講解了細菌和真菌的菌懸液製備方法，但有時候我們需要製作一些特殊的懸液，例如黴菌的孢子懸液、芽孢懸液，那麽該如何製作呢？
1、黴菌的孢子懸液
將黴菌接種至沙氏瓊脂（或馬鈴薯葡萄糖瓊脂）斜麵（或平板）進行培養至產豐富的孢子，加入稀釋劑進行洗脫（也可用接種環直接挑取一環孢子至稀釋液中），再用十倍或百倍稀釋法製成適宜濃度菌懸液。
注意事項：
（1）培養過程中不可密封培養，保持良好的透氣性有利於黴菌的生長和產孢子；
（2）不同的培養基營養存在差別，黴菌生長後期，培養基內的營養逐漸耗盡後，黴菌傾向於開始產孢子，因此在培養過程中不同培養基產孢子時間存在差異；
（3）孢子容易在空氣中漂浮擴散，因此若采用接種環挑取孢子時，應做好防擴散汙染的措施。
2、芽孢懸液
將芽孢菌接種至硫酸錳營養瓊脂（或其他產芽孢培養基）36±1℃培養5-7天（或其他合適溫度培養），刮取菌苔至稀釋液中製成懸液，將菌懸液置於65℃中水浴30min（或沸水浴10min）殺死菌體，再用十倍稀釋或百倍稀釋法製成適宜濃度的芽孢懸液。
注：製備好的菌懸液原則上應現製現用，但孢子懸液、芽孢懸液相對比較穩定，可以在2-8℃保存較長時間，可在經過驗證的期限內使用。
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