中國藥典版菌株鑒定驗證方法、圖譜及所用試劑列表

一、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus

金黃色葡萄球菌是—種自然界常見的條件致病菌，該菌為葡萄球菌屬，革蘭氏染色為陽性球菌，呈葡萄狀排列。在TSA平板上為圓形、光滑、凸起菌落， 多數菌株有黃色色素， 菌落呈黃色，也有—些菌株呈乳白色；在血平板上通常呈β溶血， 也有部分菌株不表現溶血， 在甘露醇氯化鈉瓊脂上為黃色菌落，周圍有黃色環。

金黃色葡萄球菌－血平板	金黃色葡萄球菌－ 甘露醇氯化鈉瓊脂

鑒定方法：革蘭氏染色＋血漿凝固酶試驗

(1) 革蘭氏染色金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌， 排列呈葡萄球狀， 無芽胞， 無莢膜， 直徑約為0.5μm-1μm 。

(2) 血漿凝固酶試驗將待測菌接種至胰酪大豆脈液體培養基中過夜培養， 吸取0.2-0.3ml培養物加入至0.5ml兔血漿中， 36℃培養，每半小時觀察—次結果， 觀察至6h, 完全凝固或凝固體積大於—半即為血漿凝固酶試驗陽性。金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗為陽性。

金黃色葡萄球菌染色鏡檢
血漿凝固酶試驗

注：2010版中國藥典中使用營養肉湯進行過夜培養或直接挑取菌落至0.9％氯化鈉溶液中製成菌懸液，吸取0.5ml培養物至0.5ml兔血漿中，食品國標中使用BHI 進行過夜培養，吸取0.2-0.3ml培養物至0.5ml兔血漿中。以上方法均可使用，不影響最終鑒定結果。

革蘭氏染色操作視頻 點擊查看

血漿凝固酶實驗操作視頻 點擊查看

參考資料：

《中國藥典》2010年版第二部

《GB4789.10-2016 食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》

二、大腸埃希氏菌 Escherichia coli

大腸埃希氏菌廣泛存在千人和溫血動物的腸道中， 能夠在44.5 °C 發酵乳糖產酸產氣， IMViC (靛基質、甲基紅、VP 試驗、檸檬酸鹽） 生化試驗為＋ + - －或－ + - －的革蘭氏陰性杆菌。在麥康凱平板上由於強烈發酵乳糖產酸，菌落呈桃紅色， 菌落周圍有沉澱環。

鑒定方法1 （推薦） ：革蘭氏染色＋ IMViC試驗＋乳糖發酵試驗

(1) 革蘭氏染色大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽孢杆菌。

(2) IMViC試驗即靛基質試驗、甲基紅試驗(MR) 、V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗， 挑取待測菌落至無菌生理鹽水中製成菌懸液，加入至大腸埃希氏菌鑒定條中培養24-48h , 培養結束後， 滴加對應的試劑，觀察記錄結果。多數大腸埃希氏菌反應為＋＋－－ ， 少數大腸埃希氏菌反應為－＋－－ 。

靛基質試驗：培養結束後，滴加1-2滴靛基質試劑出現玫紅色環為陽性，黃色環為陰性。

甲基紅試驗(MR)： 培養結束後，滴加數滴甲基紅試劑顯紅色為陽性， 橙黃色為陰性。

V-P試驗：培養結束後，滴加VP試劑A液與B液， 繼續培養不超過4h, 出現變紅為試驗陽性，不變紅或橙黃色為陰性。

檸檬酸鹽利用試驗：培養結束後，觀察培養基顏色變化，若由綠色變為藍色為陽性反應，不變色為陰性反應。

(3) 乳糖發酵試驗挑取待測菌落接種至乳糖發酵培養基中， 44.5℃ 培養24-48h , 大腸埃希氏菌可產酸變黃， 產氣。

大腸埃希氏菌－麥康凱瓊脂平板	大腸埃希氏菌染色鏡檢	乳糖發酵試驗

注：乳糖發酵試驗也可選用EC肉湯、乳糖膽鹽發酵培養基、乳糖蛋白腖培養基等， 在麥康凱液體培養基中也可觀察到大腸埃希氏菌產酸產氣現象。

鑒定方法2: 使用博檢革蘭氏陰性菌鑒定係統

挑取待測菌落至無菌生理鹽水中製成約10⁹CFU/ml 的菌懸液， 接種至革蘭氏陰性菌鑒定條中36 °C 培養18-24h , 觀察記錄結果輸入博檢數據庫係統可查詢鑒定結果。

鑒定方法3 (2010版中國藥典鑒定方法）：

挑取待測菌接種至MUG培養基36°C培養5-24h ,繼續滴加靛基質試劑觀察靛基質反應。

若靛基質與MUG 同為陽性反應， 則可確認為大腸埃希氏菌。

MUG培養基的使用方法視頻 點擊查看

若MUG陽性， 靛基質陰性，需將待測菌接種至曙紅亞甲基藍瓊脂平板(EMB) 或麥康凱瓊脂平板進行下—步判斷。大腸埃希氏菌在EMB平板上通常為紫黑色菌落， 常有金屬光澤， 在麥康凱瓊脂上通常為桃紅色菌落。

參考資料：

《GB4789.38-2012 食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數》

《中國藥典》2010年版第二部

三、沙門氏菌 Salmonella

沙門氏菌是—種常見的腸道致病菌，為革蘭氏陰性杆菌。該菌由於菌型較多，在選擇性平板上有多種形態，生化反應也有多個生化群， 在鑒定上要比其他菌複雜—些。大多數沙門氏菌不發酵乳糖和蔗糖，產硫化氫， 在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂(XLD) 平板上呈無色至淡紅色透明菌落，有黑色中心，少數不產硫化氫的沙門氏菌在XLD 平板上菌落無黑色中心。極少數的乳糖發酵型沙門氏菌在XLD平板上為黃色菌落，有或無黑色中心。

XLD平板上菌落形態	沙門氏菌染色鏡檢

鑒定方法1 :三糖鐵＋沙門氏菌生化鑒定條

由於沙門氏菌生化群較多， 參考食品標準， 主要可分為以下幾種結果

(1) 典型沙門氏菌反應三糖鐵反應為K/A （斜麵產堿紅色，底層產酸黃色），硫化氫陽性（底層變黑），沙門氏菌生化鑒定條中前四項反應分別為靛基質－，尿素酶－， KCN- ，賴氨酸脫羧酶＋，此時可判斷為典型沙門氏菌。標準菌株通常為此種反應類型（如乙型副傷寒沙門菌） 。極少數沙門氏菌在三糖鐵上反應為A/A （斜麵底層均為黃色），硫化氫陽性。

(2) 靛基質陽性變體沙門氏菌與(1) 典型沙門氏菌反應相比，唯—不同的是靛基質反應為陽性。此時需繼續觀察鑒定條中的甘露醇和山梨醇反應，若此兩項反應均為陽性，結合血清學試驗進行判斷。

(3) 個別變體尿素酶陽性沙門氏菌與(1) 典型沙門氏菌反應相比， 唯—不同的是尿素酶反應為陽性。此種沙門氏菌極其罕見， 此時需做血清試驗進行判斷。

(4) KCN 陽性沙門氏菌與(1) 典型沙門氏菌反應相比， 唯—不同的是KCN 反應為陽性。此時需繼續觀察鑒定條中的水楊昔、山梨醇、丙二酸鹽、ONPG 和衛矛醇反應，是否符合沙門氏菌生化群IV或V （生化群IV反應為水楊昔＋、山梨醇＋、丙二酸鹽－、ONPG- 、衛矛醇－，生化群V反應為水楊甘－、山梨醇＋、丙二酸鹽－、ONPG+ 、衛矛醇＋） 。

(5) 不產硫化氫沙門氏菌與(1) 典型沙門氏菌反應相比，三糖鐵反應為K/A, 底層不變黑。此時需補做ONPG 試驗，若ONPG 為陰性， 也為沙門氏菌。若賴氨酸為陰性， 則有可能為甲型副傷寒沙門菌， 需做血清試驗。

鑒定方法2: 博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統

挑取待測菌落至無菌生理鹽水中製成約10⁹CFU /ml 的菌懸液，接種至革蘭氏陰性菌鑒定條中36℃培養18-24h , 觀察記錄結果， 輸入博檢數據庫係統可查詢鑒定結果。

參考資料《GB4789.4-2016 食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》

四、銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa

銅綠假單胞菌為非發酵革蘭氏陰性杆菌， 專性需氧在自然界中廣泛存在， 大多數菌株可產生水溶性熒光素及綠膿菌素。在淏化十六院基三甲桉瓊脂平板上菌落呈綠色， 在366nm 波長紫外燈下觀察可見熒光。

鑒定方法：

(1) 革蘭氏染色為陰性杆菌。

(2) 氧化酶試驗：將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用細玻璃棒或—次性接種針挑取單個菌落，塗在試紙上，30s內變為藍色或藍紫色為陽性反應。銅綠假單胞菌氧化酶試驗為陽性。

(3) 綠膿菌素試驗：挑取待測菌落接種在綠膿菌素測定用培養基(PDP) 斜麵上，培養24小時，觀察斜麵有無色素。如有色素， 在試管內加氯仿3.0 - 5.0ml, 充分震搖，使培養物中的綠膿菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈現綠色時， 加1mol/L鹽酸約1ml , 震搖後靜置片刻上層鹽酸溶液中呈現粉紅至紅色實驗結果為陽性，否則為陰性。大多數銅綠假單胞菌綠膿菌素試驗為陽性。

綠膿菌素試驗

氧化酶實驗操作視頻 點擊查看

綠膿菌素測定（PDP）試驗操作視頻 點擊查看

注：革蘭氏染色陰性杆菌＋氧化酶試驗陽性＋綠膿菌素試驗陽性可以確證大多數的銅綠假單胞菌。若綠膿菌素試驗為陰性，則需補充熒光試驗和乙酰胺產氨試驗， 熒光試驗和乙酰胺產氨均為陽性， 也可判定為銅綠假單胞菌。

(4) 熒光試驗：挑取待測菌接種於金氏B培養基上，於36 °C 士1 °C 恒溫箱培養24h 5d 。每天需取出在366nm波長紫外光下觀察是否有熒光。

(5) 產氨試驗：挑取待測菌接種到乙酰胺肉湯，在36土1 °C 下培養20h-24h 。

立即觀察結果， 若出現深黃色到磚紅色的沉澱， 則為陽性結果， 否則為陰性。

五、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis

枯草芽孢杆菌為革蘭氏陽性芽孢杆菌，在TSA上菌落表麵粗糙不透明，有褶皺，菌落較大， 呈不規則狀， 在7 ％氯化鈉中生長， V-P測定陽性，硝酸鹽還原陽性，分解D－甘露醇產酸，不利用丙酸鹽。

鑒定方法：

(1) 革蘭氏染色為陽性杆菌。

(2) 在硫酸錳營養瓊脂上培養5-7天，進行芽孢染色，可觀察到橢圓形或卵圓形芽孢。

(3) 生化試驗做7％氯化鈉生長試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗、D －甘露醇發酵試驗和丙酸鹽利用試驗。

7％氯化鈉生長試驗：挑取待測菌落接種至7％氯化鈉生長管中， 36℃培養2-7天，渾濁生長為陽性， 不生長為陰性。枯草芽抱杆菌為陽性反應。

V-P試驗：挑取待測菌落接種至V-P 生化管中， 36 士1 °C 培養2-4天，滴加V-P試劑A液與B液後， 繼續培養不超過4h,出現紅色反應為陽性，不變色或橙黃色為陰性。枯草芽孢杆菌V-P 為陽性反應。

硝酸鹽還原試驗：挑取待測菌落接種至硝酸鹽還原肉湯中， 36℃培養2-4天，滴加硝酸鹽還原試劑A液與B液數分鍾後，若出現變紅，則為硝酸鹽還原陽性反應。若不變紅，需繼續加入鋅粉或鋅粒，若仍不變紅，也為陽性反應。若加入鋅粒後變紅， 則為硝酸鹽還原陰性反應。枯草芽孢杆菌硝酸鹽還原反應陽性。

D－甘露醇發酵試驗：挑取待測菌落接種至D－甘露醇發酵管中， 36 士1℃ 培養2-5 天， 若出現變黃， 則為陽性反應，不變色為陰性反應。枯草芽孢杆菌為陽性反應。

丙酸鹽利用試驗：挑取待測菌落接種至丙酸鹽培養基中， 36 士1℃ 培養48h, 若培養基變為藍色，則為陽性反應，不變色為陰性反應。枯草芽孢杆菌不利用丙酸鹽，為陰性反應。

7％氯化鈉生長試驗	V-P試驗	硝酸鹽還原試驗	D－甘露醇發酵試驗

注：也可使用芽孢鑒定條進行鑒定，芽孢鑒定條包括厭氧生長試驗、V-P反應、檸檬酸鹽利用試驗、丙酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗、澱粉水解試驗、7％氯化鈉生長試驗、明膠液化試驗、pH5.7生長試驗、L 阿拉伯糖發酵試驗、D－甘露醇發酵試驗、D－木糖發酵試驗，除鑒定枯草芽孢杆菌外， 也可鑒定常見的地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蠟樣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌等。

參考資料：《GBT26428-2010 飼用微生物製劑中枯草芽孢杆菌的檢測》

六、梭菌 Clostridium

梭菌是—群革蘭陽性杆菌， 專性厭氧，能產生芽抱，芽抱在菌體內膨大， 使菌體呈梭形或鼓梯形。大多數為非致病菌，少數為致病菌， 常見的致病菌有產氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風梭菌、艱難梭菌等。該菌屬對慶大黴素不敏感， 因此常用含慶大黴素的哥倫比亞瓊脂進行分離培養。

鑒定方法：

梭菌屬的種類較多， 多數生化反應不—致，可使用染色＋過氧化氫酶試驗＋ PCR方法鑒定。梭菌革蘭氏染色為陽性杆菌， 過氧化氫酶陰性，若此兩項特征符合，可繼續通過PCR方法進—步鑒定是否為梭菌。

過氧化氫酶試驗：用塑料接種環挑取菌落至3 ％過氧化氫中（或將3 ％過氧化氫滴加至菌落上） ， 觀察是否有氣泡產生， 產生大量氣泡為過氧化氫酶陽性。梭菌屬過氧化氫酶反應為陰性， 不產生氣泡。（注：不可使用鐵製品挑取菌落，不可使用血平板培養物）

參考資料：《中國藥典》2015年版第四部

七、白色念珠菌 Candida albicans

白色念珠菌又叫白色假絲酵母菌， 是—種雙相真菌。在培養基上通常表現為酵母相， 在沙氏葡萄糖瓊脂上為白色圓形光滑凸起菌落，有酵母味革蘭氏染色呈圓形或卵圓形，在念珠菌顯色培養基上呈翠綠色圓形凸起菌落。致病時通常表現為菌絲相， 菌體出芽產生芽管和假菌絲。

鑒定方法：

(1) 革蘭氏染色為陽性球形或卵圓形菌，比金黃色葡萄球菌大5-6倍，有時可見菌體之間有假菌絲。

(2) 念珠菌顯色培養基呈翠綠色圓形凸起菌落。

(3) 芽管試驗：將待測菌接種至1 ％吐溫80 －玉米瓊脂培養基培養24-48h, 挑取少許培養物接種千加有—滴血清的在玻片上， 蓋上蓋玻片， 置濕潤的平皿內， 35-37°C 培養1-3 小時， 置顯微鏡下觀察是否有芽管產生。白色念珠菌可產生芽管結構。

參考資料：《中國藥典》2010 年版第二部

八、黑曲黴 Aspergillus niger

黴菌的鑒定常通過平板上的菌落形態及低倍顯微鏡下的菌絲形態觀察進行菌屬的判斷。黑曲黴在沙氏葡萄糖瓊脂上20-25℃培養48-120h , 逐日觀察， 初期可觀察到產生白色菌絲， 呈輻射狀生長， 菌絲老化後逐漸變為黃褐色， 菌絲頂部產生黑色孢子。

乳酸酚棉藍染色鏡檢用接種鉤挑取菌絲及抱子（或直接挑取小塊培養基）至載玻片， 滴加數滴乳酸酚棉藍染色液，蓋上蓋玻片， 在低倍鏡下觀察結構。黑曲黴產孢結構頂囊為接近球形， 周圍環繞黑色孢子，孢子呈圓形或橢圓形。

參考資料《GB4789 .16-2016 食品微生物學檢驗常見產毒黴菌的形態學鑒定》

所需試劑列表(點擊產品名稱即可查看產品詳情)：

產品貨號	產品名稱	規格	價格
金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 鑒定方法：凍幹菌種複蘇接種至TSA平板，革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。
HBPM034-7	胰酪大豆腖瓊脂培養基平板(9cm)	9cm*10個/包	60
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HBPT4114-19-1	胰酪大豆腖液體培養基管	10ml*20支/盒	160
HB4117-4	凍幹兔血漿	0.5ml*10	75
大腸埃希氏菌 Escherichia coli 鑒定方法：凍幹菌種複蘇接種至TSA平板，革蘭氏染色鏡檢及IMViC生化試驗或博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統生化檢測。
HBPM034-7	胰酪大豆腖瓊脂培養基平板(9cm)	9cm*10個/包	60
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HBPT8420	乳糖發酵培養基管	10ml*20支/盒	200
HBIG13	HBI大腸杆菌生化鑒定條	5條/盒	100
HB8679	博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統	5條/套	300
HB8280	甲基紅試劑盒	5ml*2	20
HB8281	V-P試劑盒	5ml*4	20
HB8279	Kovacs氏靛基質試劑盒	5ml*2	20
GS070	無菌液體石蠟	1.7ml*20	20
乙型副傷寒沙門氏菌 Salmonella paratyphi B 鑒定方法：凍幹菌種複蘇接種至TSA平板，三糖鐵試驗、革蘭氏染色鏡檢及接種至沙門氏菌生化鑒定條或博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統生化檢測。
HBPM034-7	胰酪大豆腖瓊脂培養基平板(9cm)	9cm*10個/包	60
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HBPT008-5	三糖鐵瓊脂培養基管（中國藥典）	20支/盒	160
HBIG01	HBI沙門氏菌生化鑒定條(GB)	5條/盒	175
HB8679	博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統	5條/套	300
HB8281	V-P試劑盒	5ml*4	20
HB8279	Kovacs氏靛基質試劑盒	5ml*2	20
GS070	無菌液體石蠟	1.7ml*20	20
銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa 鑒定方法：凍幹菌種複蘇接種至TSA平板，革蘭氏染色鏡檢、氧化酶實驗、綠膿菌素測定試驗、熒光試驗及乙酰胺產氨試驗。
HBPM034-7	胰酪大豆腖瓊脂培養基平板(9cm)	9cm*10個/包	60
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HB2100	氧化酶試紙	10片	25
HBPT5187	綠膿菌素測定培養基管（PDP）13ml	20支/盒	160
HBPT8484-1	金氏B培養基管	5ml*20支/盒	160
HB8653	乙酰胺肉湯生化管	20支	40
HB8654	鈉氏試劑	5ml*2	60
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 鑒定方法：凍幹菌種複蘇接種至TSA平板，革蘭氏染色及芽抱染色鏡檢。並做7％氯化鈉生長試驗、VP試驗、硝酸鹽還原試驗、D －甘露酵發酵試驗、丙酸鹽利用試驗。
HBPM034-7	胰酪大豆腖瓊脂培養基平板(9cm)	9cm*10個/包	60
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HB8300-2	芽孢染色液	5ml*4	40
HBPM4177-1	硫酸錳營養瓊脂平板	10個/包	80
GB181	7%氯化鈉生長生化管（枯草芽孢杆菌）	20支/盒	35
GS003	MR-VP	20支	30
HB8281	V-P試劑盒	5ml*4	20
GB182	硝酸鹽還原（枯草芽孢杆菌）	20支/盒	35
HB8282	硝酸鹽還原試劑盒	5ml*4	20
GB179	D-甘露醇發酵管（枯草芽孢杆菌）	20支	25
GB180	丙酸鹽（枯草芽孢杆菌）	20支	60
HBIG14	HBI芽孢杆菌生化鑒定條	5條/盒	200
HB8282	硝酸鹽還原試劑盒	5ml*4	20
HB8281	V-P試劑盒	5ml*4	20
HB9139	盧戈氏碘液	5ml*4支	40
白色念珠菌 Candida albicans 鑒定方法： 凍幹菌種複蘇後接種至SDA平板上，劃線接種千念珠菌顯色平板，革蘭氏染色鏡檢及產芽管試驗。
HBPM0253-8	沙氏葡萄糖瓊脂平板	9cm*10個	70
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HB7015	念珠菌顯色培養基	1000ml	750
HB0236-1	1%吐溫80-玉米瓊脂培養基	250g	250
黑曲黴 Aspergillus niger 鑒定方法：凍幹菌種複蘇後接種至SDA平板上，培養至產豐富抱子，鏡檢觀察菌絲及抱子形態。
HBPM0253-8	沙氏葡萄糖瓊脂平板	9cm*10個	70
HB8296	乳酸酚棉藍染色液	5ml*8	40
生孢梭菌 Clostridium sporogenes 鑒定方法：凍幹菌種複蘇接種至硫乙醇酸鹽流體培養基中，劃線至哥倫比亞瓊脂平板並做革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗。
HB5190-5	硫乙醇酸鹽流體培養基（中國藥典）	250g	115
HB8278	革蘭氏染色液試劑盒	5ml*8	40
HB0124-1	哥倫比亞瓊脂培養基（中國藥典）	250g	235
HB0124-1a	硫酸慶大黴素	1ml*5支	40
HBPM0124-1	哥倫比亞瓊脂平板	9cm*10個/包	80
HB8650	3%過氧化氫酶試劑	20支	20

注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。

 

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