1 範圍
本標準規定了食品中阪崎腸杆菌（Enterobacter sakazakii）的檢驗方法。
本標準適用於嬰幼兒配方食品、乳和乳製品及其原料中阪崎腸杆菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 恒溫培養箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 恒溫水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 均質器。
2.6 振蕩器。
2.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
2.8 無菌錐形瓶：容量100 mL、200 mL、2000 mL。
2.9 無菌培養皿：直徑90 mm。
2.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
2.11 全自動微生物生化鑒定係統。
3 培養基和試劑
3.1 緩衝蛋白腖水（buffer peptone water，BPW）：見附錄A 中A.1。
3.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯-萬古黴素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin
medium，mLST-Vm）：見附錄A 中A.2。
3.3 阪崎腸杆菌顯色培養基。
3.4 胰蛋白腖大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）：見附錄A 中A.3。
3.5 生化鑒定試劑盒。
3.6 氧化酶試劑：見附錄A 中A.4。
3.7 L-賴氨酸脫羧酶培養基：見附錄A 中A.5。
3.8 L-鳥氨酸脫羧酶培養基：見附錄A 中A.6。
3.9 L-精氨酸雙水解酶培養基：見附錄A 中A.7。
3.10 糖類發酵培養基：見附錄A 中A.8。
3.11 西蒙氏檸檬酸鹽培養基：見附錄A 中A.9。
第一法阪崎腸杆菌的檢驗
4 檢驗程序
阪崎腸杆菌檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 前增菌和增菌
取檢樣100 g（mL）加入已預熱至44 ℃裝有900 mL 緩衝蛋白腖水的錐形瓶中，用手緩緩地搖動至充分溶解，36 ℃±1 ℃培養18 h±2 h。移取1 mL 轉種於10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養24 h±2h。
5.2 分離
5.2.1 輕輕混勻mLST-Vm 肉湯培養物，各取增菌培養物1 環，分別劃線接種於兩個阪崎腸杆菌顯色培養基平板，36 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。
5.2.2 挑取1 個～5 個可疑菌落，劃線接種於TSA 平板。25 ℃±1 ℃培養48 h±4 h。
5.3 鑒定
自TSA 平板上直接挑取黃色可疑菌落，進行生化鑒定。阪崎腸杆菌的主要生化特征見表1。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定係統。
第二法 阪崎腸杆菌的計數
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 固體和半固體樣品：無菌稱取樣品100 g、10 g、1 g 各三份，加入已預熱至44 ℃分別盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，輕輕振搖使充分溶解，製成1:10 樣品勻液，置36 ℃±1 ℃培養18 h±2 h。分別移取1 mL 轉種於10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養24 h±2 h。
7.1.2 液體樣品：以無菌吸管分別取樣品100 mL、10 mL、1 mL 各三份，加入已預熱至44 ℃分別盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中，輕輕振搖使充分混勻，製成1:10 樣品勻液，置36 ℃±1 ℃培養18h±2h。分別移取1 mL 轉種於10 mL mLST-Vm 肉湯，44 ℃±0.5 ℃培養24 h±2 h。
7.2 分離、鑒定
同5.2，5.3。
8 結果與報告
綜合菌落形態、生化特征，根據證實為阪崎腸杆菌的陽性管數，查MPN 檢索表，報告每100 g（mL）樣品中阪崎腸杆菌的MPN 值（見附錄Ｂ中表B.1）
附錄A
（規範性附錄）
培養基和試劑
A.1 緩衝蛋白腖水（BPW）
A.1.1 成分
蛋白腖 10.0g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 9.0 g
磷酸二氫鉀 1.5 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2
A.1.2 製法
加熱攪拌至溶解,調節pH，121 ℃高壓滅菌15 min。
A.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯-萬古黴素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）
A.2.1 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（mLST）肉湯
A.2.1.1 成分
氯化鈉 34.0 g
胰蛋白腖 20.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸二氫鉀 2.75 g
磷酸氫二鉀 2.75 g
十二烷基硫酸鈉 0.1 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.2.1.2 製法
加熱攪拌至溶解，調節 pH。分裝每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。
A.2.2 萬古黴素溶液
A.2.2.1 成分
萬古黴素 10.0 mg
蒸餾水 10.0 mL
A.2.2.2 製法
10.0 mg 萬古黴素溶解於10.0 mL 蒸餾水，過濾除菌。萬古黴素溶液可以在0 ℃～5 ℃保存15 天。
A.2.3 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯-萬古黴素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）
每 10 mL mLST 加入萬古黴素溶液0.1 mL，混合液中萬古黴素的終濃度為10 μg/ mL。
注：mLST-Vm 必須在24 h 之內使用。
A.3 胰蛋白腖大豆瓊脂（TSA）
A.3.1 成分
胰蛋白腖 15.0 g
植物蛋白腖 5.0 g
氯化鈉 5.0 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.3±0.2
A.3.2 製法
加熱攪拌至溶解，煮沸 1 min，調節pH，121 ℃高壓15 min。
A.4 氧化酶試劑
A.4.1 成分
N,N,N',N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽 1.0 g
蒸餾水 100 mL
A.4.2 製法
少量新鮮配製，於冰箱內避光保存，在 7 d 之內使用。
A.4.3 試驗方法
用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落，塗布在氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。如果濾紙在10 s 之內未變為紫紅色、紫色或深藍色，則為氧化酶試驗陰性，否則即為氧化酶實驗陽性。
注：實驗中切勿使用鎳/鉻材料。
A.5 L-賴氨酸脫羧酶培養基
A.5.1 成分
L-賴氨酸鹽酸鹽（L-lysine monohydrochloride） 5.0 g
酵母浸膏 3.0 g
葡萄糖 1.0 g
溴甲酚紫 0.015 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.5.2 製法
將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5 mL，121 ℃高壓15 min。
A.5.3 實驗方法
挑取培養物接種於 L-賴氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液麵下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。L-賴氨酸脫羧酶試驗陽性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。
A.6 L-鳥氨酸脫羧酶培養基
A.6.1 成分
L-鳥氨酸鹽酸鹽（L-ornithine monohydrochloride） 5.0 g
酵母浸膏 3.0 g
葡萄糖 1.0 g
溴甲酚紫 0.015 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.6.2 製法
將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。
A.6.3 實驗方法
挑取培養物接種於 L-鳥氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液麵下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。L-鳥氨酸脫羧酶試驗陽性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。
A.7 L-精氨酸雙水解酶培養基
A.7.1 成分
L-精氨酸鹽酸鹽（L-arginine monohydrochloride） 5.0 g
酵母浸膏 3.0 g
葡萄糖 1.0 g
溴甲酚紫 0.015 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.7.2 製法
將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。
A.7.3 實驗方法
挑取培養物接種於 L-精氨酸脫羧酶培養基，剛好在液體培養基的液麵下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。L-精氨酸脫羧酶試驗陽性者，培養基呈紫色，陰性者為黃色。
A.8 糖類發酵培養基
A.8.1 基礎培養基
A.8.1.1 成分
酪蛋白（酶消化） 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
酚紅 0.02 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.8.1.2 製法
將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝5 mL。121 ℃高壓15 min。
A.8.2 糖類溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）
A.8.2.1 成分
糖 8.0 g
蒸餾水 100 mL
A.8.2.2 製法
分別稱取 D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖類成分各8 g，溶於100 mL 蒸餾水中，過濾除菌，製成80 mg/mL 的糖類溶液。
A.8.3 完全培養基
A.8.3.1 成分
基礎培養基 875 mL
糖類溶液 125 mL
A.8.3.2 製法
無菌操作，將每種糖類溶液加入基礎培養基，混勻；分裝到無菌試管中，每管 10 mL。
A.8.4 實驗方法
挑取培養物接種於各種糖類發酵培養基，剛好在液體培養基的液麵下。30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。糖類發酵試驗陽性者，培養基呈黃色，陰性者為紅色。
A.9 西蒙氏檸檬酸鹽培養基
A.9.1 成分
檸檬酸鈉 2.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 1.0 g
磷酸二氫銨 1.0 g
硫酸鎂 0.2 g
溴百裏香酚藍 0.08 g
瓊脂 8.0 g～18.0 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.9.2 製法
將各成分加熱溶解，必要時調節 pH。每管分裝10 mL，121 ℃高壓15 min，製成斜麵。
A.9.3 實驗方法
挑取培養物接種於整個培養基斜麵，36 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察結果。陽性者培養基變為藍色。
附錄B
（規範性附錄）
阪崎腸杆菌最可能數（MPN）檢索表
B.1 阪崎腸杆菌最可能數（MPN）檢索表
每100 g（mL）檢樣中阪崎腸杆菌最可能數（MPN）的檢索見表B.1。
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