一、大腸菌群簡介
大腸菌群是革蘭氏陰性、無芽孢、氧化酶陰性的杆狀細菌，為需氧和兼性厭氧，可在有膽鹽（或具有其他抑製生長的表麵活性劑）存在的情況下生長，通常可在36℃士2℃發酵乳糖並產酸和醛。主要由腸杆菌科中四個屬內的一些細菌所組成，即埃希氏菌屬、檸檬酸杆菌屬、克雷伯氏菌屬以及腸杆菌屬。
大腸菌群主要來源於人畜糞便，故以此作為糞便汙染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否汙染腸道致病菌的可能。如果大腸菌群存在於食品中，表明未作有效的消毒處理、加工後保存條件不良或消毒後又受到汙染。快速檢驗這些細菌，有助於食品的衛生管理，維護消費者的食用安全。
二、參考標準
《GB8538-2016 飲用天然礦泉水：大腸菌群檢驗》
三、檢驗原理
3.1 多管發酵法
根據大腸菌群細菌具有的生物特性，如革蘭氏陰性無芽孢杆菌，在37℃培養24h能發酵乳糖並產氣的特點，將不同量的水樣接種到含乳糖的培養基中，經培養後根據陽性反應結果可測出原水樣中大腸菌群的最可能數(MPN)。
3.2 濾膜法
采用孔徑為0.45μm水相微孔薄膜，將水中所含的細菌截留在濾膜上，然後將濾膜貼在選擇性鑒別培養基上，經37℃培養24h後，大腸菌群細菌在濾膜上長出具有特征性的菌落，直接計數典型菌落數，計算出每100mL水樣中所含的大腸菌群數。
大腸菌群可產生β-半乳糖苷酶，分解培養基中的酶底物-茜素-β-D-半乳糖苷（以下簡稱Aliz-gal），使茜素遊離並與固體培養基中的鋁、鉀、鐵、銨離子結合形成紫色（或紅色）的鼇合物，使菌落呈現相應的顏色。
四、檢驗方法以及結果分析
4.1 多管發酵法
大腸菌群多管發酵法檢驗程序見圖1。
圖1 大腸菌群檢驗程序
4.1.1 礦泉水水源水檢測
4.1.1.1 推測性檢驗
a) 吸取10mL水樣接種到盛有10mL雙料乳糖膽鹽發酵培養液的試管中，共接種5份；
b) 吸取1mL水樣接種到盛有10mL單料乳糖膽鹽發酵培養液的試管中，共接種5份；
c) 吸取1mL水樣接種到9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻，用5mL滅菌吸管吸取5mL稀釋液，分別加到5支盛有10mL單料乳糖膽鹽發酵培養液的試管中，每管1mL(即0.1mL水樣)；
d) 輕搖試管，使液體充分混合，置36℃±1℃培養箱內培養25h。觀察每管是否產氣，若有氣體產生該管則為推測性檢驗陽性，如不產氣則為大腸菌群陰性。
質控菌株接種到乳糖膽鹽發酵培養基管中，培養結果如下圖所示：
圖2 標準菌株在乳糖膽鹽發酵培養基中生長情況
4.1.1.2 確證性試驗
a) 自推測性檢驗陽性管中取一接種環培養液，接種到亮綠乳糖膽鹽培養液(BGLB)管中，置36℃±1℃培養箱中培養48h；
b) 觀察BGLB管中的產氣情況，如有氣體產生，就可確定為“大腸菌群陽性”；如無氣體產生則為“大腸菌群陰性”。記下BGLB管裏產氣的陽性試管數，查MPN表可得出水樣中大腸菌群的MPN值。
質控菌株接種到BGLB管中，培養結果如下圖所示：
圖3 大腸菌群在BGLB肉湯中生長情況
4.1.1.3 MPN值的計算
如水樣含菌量少，也可按100mL、10mL、1mL接種，那麽其實際MPN值應為表中的MPN值除以10；反之如含菌量較多，也可接種1mL、0.1mL、0.01mL，其實際MPN值應為表中的MPN值乘以10，餘此類推。
4.1.1.4 列舉說明
假設推測性檢驗15支試管中的陽性管數如下:①在接種量為10mL的管中有5支管陽性；②在接種量為1mL的管中有4支管陽性；③在接種量為0.1mL的管中有2支管陽性；
作為推測性檢驗結果為5-4-2。當把以上陽性管轉種到BGLB管裏，經培養後，作為證實性檢驗所給的結果如為5-3-1，那麽查MPN表，就可知大腸菌群的MPN值為每100mL水樣中110。接種量為100mL、10mL、1mL時，MPN值為11。如接種量為1mL、0.1mL、0.01mL時，MPN值即為1100。
表1 大腸菌群(MPN)檢索表（部分）
(總接種量55.5mL，其中5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣)
4.1.2 直接飲用的礦泉水的檢測
礦泉水出廠成品水或準備直接飲用的礦泉水，一般不應有汙染，需要經常檢驗，可按下法進行接種。
4.1.2.1 推測性檢驗
a) 用10mL的滅菌吸管向5支盛有10mL雙料乳糖膽鹽發酵培養液的試管中，每管接種10mL水樣。
b) 置36℃±1℃培養箱中培養24h，觀察每支管的產氣情況，如有氣體產生，則認為推測性檢驗陽性。
4.1.2.2 確證性試驗
操作步驟同礦泉水水源水檢驗。
4.1.2.3 MPN值的計算
當經過證實性檢驗後，5管10mL水樣結果中，陽性反應的管數對應的MPN 值及其95%的可信限範圍見表2。
表2 用5管10mL水樣時各種陽性和陰性結果組合的MPN值及其95%的可信限
|
陽性反應管數 |
MPN/100mL |
95%可信限 |
|
|
下限 |
上限 |
||
|
0 |
0 |
0 |
6.0 |
|
1 |
2.2 |
0.1 |
12.6 |
|
2 |
5.1 |
0.5 |
19.2 |
|
3 |
9.2 |
1.6 |
29.4 |
|
4 |
16 |
3.3 |
56.9 |
|
5 |
>16 |
8.0 |
無限 |
4.2 濾膜法
4.2.1 操作步驟
4.2.1.1 用滅菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙麵向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣(如水樣含菌數較多，可減少過濾水樣量，或將水樣稀釋)注入濾器中，打開濾器閥門，在-5.07×104 Pa（負0.5大氣壓）下抽濾。
4.2.1.2 水樣濾完後，再抽氣約5s，關上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基上，濾膜截留細菌麵向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然後將平皿倒置，放入36℃±1℃恒溫箱內培養24h±2h。
4.2.1.3 觀察濾膜上麵的菌落特征。大腸菌群典型菌落在遠藤培養基上具有以下特征：
a) 紫紅色，具有金屬光澤的菌落；
b) 深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；
c) 淡紅色，中心色較深的菌落；
d) 挑取不少於3個(不足3個則全挑)可疑菌落，進行革蘭氏染色鏡檢觀察。
質控菌株接種到品紅亞硫酸鈉培養基平板上，培養結果如下圖所示：
圖4 大腸菌群在品紅亞硫酸鈉培養基平板上生長情況
注：A：大腸埃希氏菌ATCC 25922；B：大腸埃希氏菌ATCC 8739；C：弗氏檸檬酸杆菌ATCC 43864
4.2.1.4 凡係革蘭氏陰性無芽孢杆菌，再接種乳糖蛋白腖培養液，經36℃±1℃培養24h±2h後，如產酸產氣則判定為大腸菌群陽性。
圖5 大腸埃希氏菌ATCC 25922革蘭氏染色鏡檢結果
圖6 質控菌株在乳糖蛋白腖培養液中生長情況
4.2.2 結果與報告
濾膜上的大腸菌群菌落數按下列公式計算，以每100mL水樣中的大腸菌群數報告結果：
每100mL水樣中大腸菌群菌落數(CFU/100mL)=確證為大腸菌群菌落數(CFU)×100/過濾的試樣量(mL)
舉例說明：
濾膜上有100個典型菌落，挑取10個典型菌落（可疑菌落）做革蘭氏染色鏡檢，發現有8個菌落為革蘭氏陰性無芽孢杆菌，這8個菌落接種乳糖蛋白腖培養液，培養後，有6支管產酸產氣，為大腸菌群陽性。
則每100mL水樣中大腸菌群菌落數為：（100×6/10×100）/100=60（CFU/100mL）
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