化妝品微生物標準檢驗方法綠膿杆菌及注解
中華人民共和國國家標準
化妝品微生物標準檢驗方法綠膿杆菌 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.4－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Pseudomonas aeruginosa
綠膿杆菌在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力，常引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染後，常使病情惡化，並可引起敗血症，因此，在化妝品衛生標準中規定不得檢出綠膿杆菌。
1 方法提要
根據本菌生物學特征：革蘭氏陰性杆菌，氧化酶陽性，能產生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下生長等，可與類似菌相區別。
2 培養基和試劑
2.1 SCDLP 液體培養基
見GB 7918.1-87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
2.2 十六烷三甲基溴化銨培養基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白腖 10g
氯化鈉 5g
十六烷三甲基溴化銨 0.3g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
製法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.4～7.6，加入瓊脂，115℃(10 1b)20min滅菌後，製成平板備用。
2.3 乙酰胺培養基
成分：乙酰胺 10.0g
氯化鈉 5.0g
無水磷酸氫於鉀 1.39g
無水磷酸二氫鉀 0.73g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g
酚紅 0.012g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000ml
製法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃(15 1b)20min高壓滅菌後，製成平板備用。
2.4 綠膿菌色素測定用培養基
成分： 蛋白腖 20g
氯化鎂 1.4g
硫酸鉀 10g
瓊脂 18g
甘油(化學純) 10g
蒸餾水 1000ml
製法：將蛋白腖、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝於試管內，115℃(10 1b)20min高壓滅菌後，製成斜麵備用。
2.5 明膠培養基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白腖 5g
明膠 120g
蒸餾水 1000ml
製法：取各成分加在蒸餾水中浸泡20min，隨時攪拌加溫使溶解，調pH至7.4，分裝於試管內，經115℃(10 1b)20min滅菌後，直立製成高層備用。
2.6 硝酸鹽蛋白腖水培養基
成分： 蛋白腖 10g
酵母浸膏 3g
硝酸鉀 2g
亞硝酸鈉 0.5g
蒸餾水 1000ml
製法：將蛋白腖和酵母浸膏加到蒸餾水中，加溫使溶解，調pH為7.2，煮沸過濾後補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃(10 1b)20min滅菌後備用。
2.7 普通瓊脂斜麵培養基
成分：蛋白腖 10g
牛肉膏 3g
氯化鈉 5g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000ml
製法：除瓊脂，將其餘成分溶解於蒸餾水中，調pH為7.2～7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃(15 1b)15min高壓滅菌後，製成斜麵備用。
３ 儀器
3.1 培養箱：37℃、42℃。
3.2 錐形燒瓶。
3.3 試管。
3.4 滅菌平皿。
3.5 滅菌刻度吸管。
3.6 顯微鏡。
3.7 載玻片。
3.8 接種針、接種環。
3.9 電爐。
3.10 高壓消毒鍋。
4 操作步驟
4.1 增菌培養：取1：10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養基中，置37℃培養18～24h。如有綠膿杆菌生長，培養液表麵多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。
注：如無SCDLP液體培養基時，可用普通肉湯培養基。檢驗含防腐劑的化妝品時，在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
4.2 分離培養：從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37℃培養18～24h。凡綠膿杆菌在此培養基上，其菌落扁平無守型，向周邊擴散或略有蔓延，表麵濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素，此培養基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。
在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離，將菌液劃線接種於平皿中，放37℃培養24H，綠膿杆菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶紅色，其他菌不生長。
4.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，塗片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。
4.4 氧化酶試驗：取一小塊潔淨的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻璃棒挑取綠膿杆菌可疑菌落塗在濾紙片上，然後在其上滴加一滴新配製的1％二甲基對苯二胺試液，在15～30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性，若培養物不變色，氧化酶試驗陰性。
4.5 綠膿菌素試驗：取可疑菌落2～3個，分別接種在綠膿菌素測定用培養基上，置37℃培養24h，加入氯仿3～5ml，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解於氯仿液內，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中並加入1N的鹽酸1ml左右，振蕩後，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
4.6 硝酸鹽還原產氣試驗：挑取被檢的純培養物，接種在硝酸鹽腖水培養基中，置37℃培養24h，觀察結果。凡在硝酸鹽腖水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，並將亞硝酸鹽分解產生氮氣。
4.7 明膠液化試驗，取綠膿杆菌可疑菌落的純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置37℃培養24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性，如凝固不溶者為陰性。
4.8 42℃生長試驗：挑取純培養物，接種在普通瓊脂斜麵培養基上，放在41～42℃培養箱中，培養24～48h，綠膿杆菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。
5 檢驗結果報告
被檢樣品增菌分離培養後，經證實為革蘭氏陰性杆菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出有綠膿杆菌。如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和４２℃生長試驗三者皆為隉性時，仍可報告被檢樣品中有綠膿杆菌。
附加說明：
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人周淑玉。
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所負責解釋
注解：
（1）分離綠膿杆菌常用以下幾種培養基：
1）十六烷三甲基溴化銨瓊脂（CA）
2）明膠十六烷三甲基溴化銨瓊脂（GCA）
成分為：蛋白陳20g，無水氯化鎂1.4g，無水硫酸鉀10g，明膠（BG）75g，瓊脂18～20g，十六烷三甲基溴化銨（cetrimide）0.3g，甘油（CP）10ml，蒸餾水1000ml， pH7.6。在本平板上可直接觀察是否液化明膠（菌落周圍有液化環），並可測試氧化酶和綠膿色素，提前診斷。
上述這兩種培養基具有較強的選擇性和鑒別作用，除綠膿杆菌和極少數假單胞菌及革蘭氏陰性杆菌可以生長外，絕大部分革蘭氏陰性杆菌，假單胞菌及革蘭氏陽性菌的生長，完全受到抑製。因為綠膿杆菌具有可利用十六烷的溴化銨鹽這一重要特性，故很多國家已普遍利用此特性分離該菌，證明效果很好。但往往出現無色素、菌落較小、無蔓延生長等現象，因此在選取菌落時須注意，以免漏檢。
3）乙酰胺瓊脂培養基（Acetamide）主要成分為乙酰胺。乙酰胺酶是綠膿杆菌特有的酶類。綠膿杆菌能分解乙酰胺，故在此培養基上能生長，而其他菌不生長。
4）NAC瓊脂培養基，其成分為：蛋白陳20g、磷酸氫二鉀和硫酸鎂各0.3g，十六烷三甲基溴化胺（cetrimide）0.2g及萘啶酸（nalidixic acid）15mg（商稱NAC），瓊脂15g，加蒸餾水1000m1，pH為7.4。
在NAC培養基中，綠膿杆菌生長良好，有些熒光假單胞菌，惡臭假單胞菌和腐敗假單胞菌可緩慢生長或不長，而大腸埃希氏菌、誌賀氏菌、沙門氏菌、變形杆菌、克雷伯氏菌和腸道杆菌科的其他菌屬、產堿杆菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬以及葡萄球菌和鏈球菌屬等，完全受到抑製不能生長。因此NAC培養基是一種選擇性很強的綠膿杆菌培養基。日本采用NAC培養基分離化妝品中綠膿杆菌。 CTFA采用十六烷三甲基溴化銨培養基分離綠膿杆菌。在我國化妝品標準檢驗方法中規定十六烷三甲基溴化銨和乙酰胺二種培養基均可使用，
這是考慮到有的地區十六烷三甲基溴化銨不易買到。
（2）綠膿杆菌與其他常見假單胞菌及革蘭氏陰性杆菌的鑒別。
假單胞菌屬分為四個菌群：29個代表菌種。其中同人類與動物疾病有重要關係的大約有10種，而綠膿杆菌（pseudomonas aeruginosa）又是其中最有代表性的致病菌種。常見的其他菌種有：熒光假單胞菌（PS flaorescens）、惡臭假單胞菌PS Putida）、蔥頭假單胞菌（PS cepacia）、類鼻疽假單胞菌（PS Pseudomallei）、嗜麥芽假單胞（PS maitophilia）、腐敗假單胞菌（PS Putretf aciens）、斯氏假單胞菌（PS Stutzeri）、產堿假單胞菌（PS alcaligenes）和類產堿假單胞菌（PS Pseudoalcaligenes）等九種。此外，在日常檢驗工作中尚有一些非假單胞菌屬的其他革蘭氏陰性杆菌，如氧化木糖無色杆菌（A xy-losoxidans）、產堿杆菌屬(AlcaligenesSP）和糞產堿杆菌（A faecalis）等均容易與上述假單胞菌混淆，主要鑒別列表3-1-3中。
（3）綠膿杆菌血清學試驗
在微生物諸多研究方法中，血清學方法是重要方法之一，被廣泛應用於實驗診斷中。
對綠膿杆菌血清分型的研究，早在1903年Eisenberg就已致力於這一工作。我國也進行了大量工作，以O抗原為依據，研製成了國際抗原分型係統（IATS）20型分型血清，分型率達99.4％，是當前各國分型係統中分型率高的分型方案。
綠膿杆菌血清學試驗采用玻片凝集法。先用PI～PⅣ多價血清分別與待檢活菌培養物作凝集試驗，陽性者再用單價分型血清作凝集試驗。判斷標準：立即出現強凝集（＋＋＋＋），3～5ｓ出現強凝集（＋＋＋），6～10s出現凝集（＋＋）， 11～15s出現凝集（＋）,16～30s不出現凝集（一），以（＋＋）以上為陽性結果。
對綠膿杆菌既作生化鑒定,又作血清凝集試驗,更有利於結果的判定。
表3-1-3 綠膿杆和其他常見假單胞菌及革蘭氏陰性杆菌的鑒別
菌種
鑒別試驗
分離十六烷三甲基溴化銨培基
綠膿菌素
鞭毛染色
氧化酶
乙酰胺酶
硝酸鹽還原產氣
液化明膠
42℃生長試驗
綠膿杆菌
+
(+)
單
+
+
+
+
+
熒光假單胞菌
-
-
多
+
－
－
+
-
惡臭假單胞菌
-
-
多
+
－
－
-
洋蔥(蔥頭)假單胞菌
(+)
-
多
+
+
－
+
(+)
類鼻疽假單胞菌
-
-
多
+
－
－
+
+
嗜麥芽假單胞菌
-
-
多
－
－
－
+
+
腐敗假單胞菌
-
-
單
+
－
－
+
(-)
斯氏假單胞菌
-
-
單
+
－
+
+
+
產堿假單胞菌
-
-
單
+
－
－
-
+
類礦產堿假單胞菌
-
-
單
+
－
－
-
+
氧化木糖無色杆菌
+
-
周
+
+
+
-
+
產堿杆菌屬
(-)
-
周
+
(-)
(-)
-
+
糞產堿杆菌
+
-
周
+
+
+
-
+
注：周表示周毛茵；（）內表示大多數。
（4）檢驗報告
1）用十六烷三甲基溴化胺瓊脂平板或乙酰胺瓊脂平板分離的疑似綠膿杆菌菌落，經染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽胞杆菌，氧化酶陽性並產生綠膿菌色素的，應報告檢出綠膿杆菌。
2）如果分離的疑似菌株為革蘭氏陰性無芽胞杆菌、氧化酶試驗陽性，不產生綠膿菌色素，而能液化明膠，硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗皆為陽性的，也應報告檢出綠膿杆菌。
3）凡符合以下情況之一者，應報告未檢出綠膿杆菌；
①從增菌液中未分離出任何菌落；
②分離的革蘭氏陰性無芽胞杆菌，氧化酶試驗陰性；
③證明不產綠膿菌色素，氧化酶陽性的革蘭低陰性無芽胞杆菌，不液化明膠，硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗均為陰性的細菌。
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