化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定及注解
中華人民共和國國家標準
化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.2－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Standard plate count
細菌總數係指1g或1ml化妝品中所含的活菌，數量。測定細菌總數可用來判明化妝品被細菌汙染的程度，以及生產單位所用的原料、工具設備、工藝流程、操作者的衛生狀況，是對化妝品進行衛生學評價的綜合依據。
本標準采用標準平板計數法。
1 方法提要
化妝品中汙染的細菌種類不同，每種細菌都有它一定的生理物質性，培養時對營養要求，培養溫度、培養時間、pH值、需氧性質等均有所不同。在實際工作中，不可能做到滿足所有菌的要求，因此所測定的結果，隻包括在本方法所使用的條件下（在卵磷脂、吐溫80營養瓊脂上，於37℃培養48h)生長的一群嗜中溫的需氯及兼性厭氧的細菌總數。
2 培養基和試劑
2.1 生理鹽水：見GB 7918-87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
2.2 卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂培養基
成分： 蛋白腖 20g
牛肉膏 3g
氯化鈉 5g
瓊脂 15g
卵磷脂 1g
吐溫80 7g
蒸餾水 1000ml
製法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80將其他成分(除瓊脂外)加到其餘蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調pH值為7.1～7.2，加入瓊脂，121℃(15 1b)20min高壓滅菌，儲存於冷暗處備用。
3 儀器
3.1 錐形燒瓶。
3.2 量筒。
3.3 pH計或精密pH試紙。
3.4 高壓消毒鍋。
3.5 試管。
3.6 滅菌平皿：直徑9cm。
3.7 滅菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。
3.8 酒精燈。
3.9 恒溫培養箱。
3.10 放大鏡。
4 操作步驟
4.1 用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢樣2ml，分別注入到兩個滅菌平甲內，每皿1ml。另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液麵)，更換一支吸管，並充分混勻，使成1:100稀釋液。吸取2ml,分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1ml。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，······等，每種稀釋度應換1支吸管。
4.2 將熔化並冷至45～50℃的卵磷脂、吐溫80、營養瓊脂培養基傾注平皿內，每皿約15ml，另傾注一個不加樣品的滅菌空平皿，作空白對照。隨即轉動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待不瓊脂凝固後，翻轉平皿，置37℃培養箱內培養48h。
5 菌落計數方法
先用肉眼觀察，點數菌落數，然後再用放大5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數後。求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半，麵其餘一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數後乘2，以代表全皿菌落數。
6 菌落計數及報告方法
6.1 首先選取平均菌落數在30～300之間的平皿，作為菌落總數測定的範圍。當隻有一個稀釋度的平均菌落數符合此範圍時，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數（見表中例１）。
6.2 若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30～300個之間，則應求出兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小於或等於2應報告其平均數，若大於2則報告其中較小的菌落數(見表中例2及例3)。
6.3 若所有稀釋度的平均菌落數均大於300個，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表中例4)。
6.4 若所有稀釋度的平均菌落數均少於30個，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表中例5)。
6.5 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300個之間，其中一個稀釋度大於300個，而相鄰的另一稀釋度小於30個時，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表中例6)。
6.6 若所有的稀釋度均無菌生長，報告數為每克或每毫升小於10個。
6.7 菌落計數的報告，菌落數在10以內時，按實有數值報告之，大於100時，采用二位有效數字，在二位有效數字後麵的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字後麵零的個數，可用10的指數來表示(見下表報告方式欄)。在報告菌落數為“不可計”時，應注明樣品的稀釋度。
細菌計數結果及報告方法
附加說明：
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人周淑玉。
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所負責解釋
注解:
（1）操作注意事項
1）盡量使菌細胞分散開，使每個菌細胞生成一個菌落，否則將會導致重大的技術誤差。
2）製成供試液後，應盡快稀釋，注皿。一般稀釋後應在1小時內操作完畢。
3）注意抑菌現象。由於防腐劑未被中和，往往使平板計數結果受影響，如低稀釋時菌落少。而高釋釋度時菌落數反而增大。
4) 對照試驗。化妝品的稀釋液（特別是1:1O的稀釋液）常帶有化妝品顆粒，有時與菌落很難區分，為了避免與細菌菌落發生混淆，可作一個檢樣稀釋液與瓊脂混合的平板，不經培養放到4℃環境中，以便計數檢樣菌落時用作對照。
另一種防止化妝品顆粒與菌落混淆的方法是培養基中加TTC
（2）細菌總數其他測定法
1) 改良的細菌總數測定法一TTC法
化妝品一般由多種物質混合而成，在進行細菌測定前雖然經過處理，但有時還會存在極難溶解的顆粒,特別是粉類化妝品和某些膏霜類化妝品。化妝品在前處理時有氣泡產生，顆粒和氣泡容易與細菌菌落相混，影響計數的準確性。
方法：在已熔化的卵磷脂吐-80營養瓊脂中，按100ml加入1m1 0.5％的氯化三苯四氮唑（2,3,5 triphenyi terazoloride ，TTC）水溶液之量加入，操作方法同標準法。培養後如係化妝品的顆粒，不見變化，如為細菌，則生成紅色菌落。配好的含TTC培養基，應先用未加TTC的對照，以觀察其計數是否有不利影響（TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑製作用）。
TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發生分解。TTC溶液在使用前應在水浴中煮沸半小時。
原理：無色的TTC是作為受氫體加入培養基中，如果有細菌存在，培養後在細菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日組成的字，因無此字）（fomazan），使菌落呈現紅色，其反應式見結構圖：
2）平板表麵塗布法
將培養基製成平板，經幹燥後，於其上滴加檢樣稀釋液0.2ml，用“L’形玻璃棒塗布於整個平板的表麵，放置片刻（約10分鍾）將平板翻轉，放入37℃溫箱內培養48小時，取出進行菌落計數，然後乘以5，即為1ml稀釋樣中的菌落數，再乘以稀釋倍數，即得每克（或每毫升）檢樣所含菌落數。
此法的優點：菌落生長在表麵，便於識別和檢查其形態，與檢樣中的顆粒易區別；細菌不必遭受融化瓊脂的熱力，不致因此而使細菌細胞受到損傷而不生長。
此法缺點：取樣量較傾注法少，代表性將受到一定的影響；本來隻有0.2ml的量又被 “L”棒蘸去部分，使菌落數受影響。
（3）菌落計數及報告注意事項
1）如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高，有兩種可能性：一是檢驗工作中發生差錯；二是受防腐劑影響。這二種情況均不可用作檢樣計數報告的依據。
2）如果平板上出現鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細胞塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈應作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數。此外，如皿內瓊脂凝固後未及時進行培養而遭受昆蟲侵入，在昆蟲爬過的地方也會出現鏈狀菌落，也不應分開來數。
3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可計報告，而應在稀釋最大的平板上，任意數其中兩個平方厘米中的菌落數，除以2求出lcm2內平均菌落數，乘以皿底麵積63.6cm2，再乘以其稀釋倍數。以此結果作報告，例如：10-1～10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀釋度的平板上任意數兩個平方厘米內的菌落數是60個，皿底直徑為9cm，則該檢樣每克（或ml）中“估計”菌落數為：
60÷2×63.6×1000＝1.9×106
63.6是按皿底直徑為9cm時計算而得的麵積，如所用乎皿底直徑不是9cm，應另求麵積。
4）鑒於檢樣中的細菌是以單個、成雙、鏈狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現的菌落可以來源於細胞塊，也可來源於單個細胞，故平板上所得需氧和兼性厭氧的菌落數應以單位重量（g）或容量（ml）的菌落形成單位（Colony formingunits CFU）報告更恰當。
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