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病毒變異的研究方法(三)



錄入時間:2009-6-17 9:01:49 來源:青島betway必威西汉姆联

   突變性質的分析:  如上所述,50~70年代中期是開始充分認識和利用病毒變異的最活躍時期,從不斷發現的病毒變異現象中人們逐漸總結出有關病毒變異的普遍規律,然而隻有在重組DNA技術及其相關技術發展起來之後,才開始真正認識變異的本質。70年代末以來,人們主要從兩個方麵研究病毒的變異:即分析已有變異的突變性質和研究人工突變對表型的影響(見下)。前者可謂研究突變的傳統方法,即首先篩選獲得具有特定表現型的變異株,然後分析野生型和變異型之間的基因組序列差異。例如,1991年Parrish等在比較分析犬細小病毒1984年流行株和1986年流行株中發現,兩者間僅有2個堿基置換;Wessner和Firlds(1993)分離了一係列具有不同乙醇抵抗力的呼腸孤病毒3變異株,發現所有的乙醇抵抗力突變位於一個編碼主要外衣殼蛋白的基因上。病毒變異株的突變分析涉及病毒基因的克隆、核苷酸序列分析等技術,請參閱本書第十五章。 
    人工突變:  如上所述,分析病毒基因突變性質的由表型至基因型的傳統方法雖然在一定範圍內取得了很大成就,但有許多缺點:首先,它僅限於獲得的突變類型;其次,因為整個病毒基因組上均發生突變,目的基因上突變的頻率相對減少;第三,由於突變是根據表型識別的,基本上不可能獲得與野生型相近的變異株,而它們恰恰對確定基因上的重要區域很有價值。  重組DNA技術使得有可能將傳統的方法顛倒過來,首先在克隆的病毒DNA(或cDNA)上通過化學或酶學方法產生人工突變,然後研究其對相關表型的影響。這種方法可產生幾乎100%的突變率,且基本上可得到所有可能的突變。例如,Matthias等(1992)在研究VPg基因擴增與口蹄疫病毒(FMDV)感染性粒子形成的關係中發現,克隆缺失或插入一個VPg基因仍能形成感染性病毒粒子,證明FMDV VPg分子數目的可塑性;盡管流感病毒血凝素(NA)的球狀頭部的結構和功能已經很清楚,但對於其杆狀部卻了解甚少,Luo等(1993)對編碼該部的基因進行缺失、插入或經堿基置換以造成人工突變,結果表明NA杆狀部的長度是可變的,缺失28aa或插入41aa並不影響感染性子代病毒的形成,同時數據表明76位的半胱氨酸對於感染性病毒形成是必需的,因為跨過該氨基酸的缺失導致不能產生感染性病毒顆粒;Threadgili等(1993)將馬傳貧病毒聚合酶基因中的dUTPase區域缺失掉,產生的缺失蛋白具有反轉錄酶活性,將缺失病毒轉染貓(FEA)細胞後產生的病毒在FEA細胞和胎馬腎細胞中的複製水平同野生型病毒相似,但在原代馬巨噬細胞培養物中複製水平極低(與野生型相比,〈1%),證明病毒編碼的dUTPase對於在體外非分化細胞中複製並不是必需的,而對於在天然宿主細胞——非分化性馬巨噬細胞中複製則是必需的。

 

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