醋酸杆菌最佳誘變劑的篩選

關鍵詞：醋酸杆菌；誘變劑；鹽酸羥胺；突變；青黴素

    醋酸杆菌在自然界中分布較廣，例如醋醪、水果、蔬菜表麵都可以找到，它是重要的工業用菌之一，能氧化酒精為醋酸，發酵調味品食醋，葡萄糖及維生素C的生產就是利用醋酸杆菌。目前國內醋酸生產菌株以中科1.41和滬釀1.01為主^[1]。目前水果醋以其食用及保健美容之功效，倍受大眾青睞，為了找到適合水果醋發酵所用的優良菌種，有必要對醋酸杆菌進行誘變，誘變是遺傳育種常用來培育優良菌種的方法，它主要包括物理因素如紫外線β射線、X射線等，化學因素如5-BU、芥子氣、亞硝酸、烷化劑等，不同的誘變劑其誘變機理^{[ 2,3]}不同，有的是改變了DNA的化學結構或是導致堿基替換、移碼突變或結合到DNA分子上等。本試驗就主要依據各種誘變劑的不同誘變機理^[2,3]，選用了前述六種誘變劑對醋酸杆菌進行誘變處理和結果分析。             

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  菌種

     醋酸杆菌，從蘋果皮上自行分離的野生型菌種。

1.1.2  儀器設備

     手撳計數機、血球計數板、SW-CJ-IF超淨工作台、YWQGO2型高壓蒸汽消毒器、WC-1型微型渦旋混合儀。

1.1.3  試劑

     紫外線：波長為253.7nm,15w的紫外燈，作用距離為20cm；

     亞硝酸、吖啶橙(F.M.P) 、5-溴尿嘧啶： 中國醫藥上海化學試劑公司生產；    

2-氨基腺嘌呤：CHEMCAL COMPANY；

     鹽酸羥胺：上海建新試劑廠生產；

     青黴素：80萬單位 華北製藥股份有限公司生產。

1.1.4  培養基

分離培養基：葡萄糖0.3g  酵母膏1g 碳酸鈣1g  瓊脂2g  酒精4%(v/v)加水至100ml；

    試管斜麵培養基：葡萄糖0.3g  酵母膏1g  碳酸鈣2g  瓊脂2g  酒精4%(v/v)加水至100ml；

    種子培養基：葡萄糖0.3g  酵母膏1g  酒精3%(v/v)加水至100ml；

    發酵培養基：葡萄糖0.3g   酵母膏1g   酒精6%(v/v)加水至100ml。

1.1.5   培養條件

     分離培養條件： 30℃  42h ；液體酵條件： 30℃  160h

1.2  試驗方法

1.2.1  測定野生型醋酸杆菌液體發酵產酸能力

     將冷藏菌種活化，分離培養，進行液體發酵，用酸堿滴定法測其酸度。

1.2.2  誘變處理

將培養好的試管用0.85%的無菌鹽水洗下，倒入帶有玻璃珠的的大試管振蕩10～15分鍾，配成菌懸液（1×10⁸個/ml），十倍稀釋，塗平板^[4]，培養，與同步培養的野生型菌株進行比較，計算致死率(誘變後的菌落數／誘變前的菌落數×100%)。

(1)紫外線誘變處理

    將上述菌懸液置於紫外燈下照射，采用不同的照射時間，避光十倍稀釋,用黑布包住培養42h,然後記數^[5]。

    (2)亞硝酸誘變處理

    取2ml一定濃度的菌懸液於一個已滅菌的空試管中，加2ml已水浴滅菌過1mol/l的醋酸緩衝液和不同體積的已過滅菌的0.2mol/l亞硝酸鈉溶液作用十分鍾，然後用0.7mol/l磷酸氫二鈉稀釋,分別塗平板記數^[4]。

    (3)吖啶橙誘變處理

    用電子天平稱取適量的誘變劑水浴滅菌。取2ml一定濃度的菌懸液於一個已滅菌的空試管中，加入不同體積的誘變劑分別塗平板記數^[5]。

    (4)5-溴尿嘧啶誘變處理

    用電子天平稱取適量的誘變劑水浴滅菌。取2ml一定濃度的菌懸液於一個已滅菌的空試管中,加入不同體積的誘變劑分別塗平板記數^[4]。

    (5)2-氨基腺嘌呤誘變處理

    用電子天平稱取適量的誘變劑水浴滅菌。取2ml一定濃度的菌懸液於一個已滅菌的空試管中，加入不同體積的誘變劑分別塗平板記數^[4]。

    (6)鹽酸羥胺誘變處理

    用電子天平稱取適量的誘變劑水浴滅菌。取2ml一定濃度的菌懸液於一個已滅菌的空試管中，加入不同體積的誘變劑分別塗平板記數。

1.5.3  青黴素測醋酸杆菌對誘變劑的敏感性

    用電子天平稱取適量的青黴素溶解，稀釋，水浴滅菌。以不同的濃度加入到誘變後的菌懸液中，將未加青黴素的菌懸液與加青黴素的菌懸液分別塗平板記數，計算相對突變率(加青黴素的菌落個數/未加青黴素的菌落個數×100%)，找出突變率最高的誘變劑。

1.5.4  液態靜止發酵試驗

    用篩選出的最佳誘變劑誘變醋酸杆菌後塗於含有碳酸鈣的平皿中，挑取透明圈與菌落直徑之比較大的菌落接種試管斜麵培養，24h左右後接入液體試管中，且酒精體積分數調到3%,培養24h後接入液體三角瓶中，最後酒精體積分數調到6%，培養7d,測其酸度，與野生型菌種同步比較，據酒精轉化率高低選出產酸高產菌株.

1.5.5  高產菌株傳代試驗

將高產菌株傳接五代，均測其發酵產酸能力，觀察其遺傳穩定性。

1.5.6           酸度測量方法：酸堿滴定法。

2             結果與討論

2.1  致死率

    野生型蘋果醋酸杆菌經不同誘變劑處理後，計算所得致死率

   依據大量資料，醋酸杆菌在偏低誘變劑劑量（70%～80%致死率）的情況下發生正突變的幾率較高，故由圖均選擇致死率75%時的誘變劑劑量進行誘變。

2.2  青黴素檢測誘變效果

2.2.1  青黴素用量將不同濃度的青黴素加入誘變後的菌懸液塗平板計數。結果青黴素效價為5ppm單位/ml和5000ppm單位/ml時，突變率為39.55%和41.53%。證明在此濃度下檢測效果最好，故選用青黴素效價為500 ppm單位/ml為最佳劑量。

2.2. 2  將適當濃度的青黴素加入到最佳誘變劑量誘變後的一定濃度的菌懸液中，使最終效價濃度

為500ppm單位/ml，分別30ºC培養48h後計數。計算相對突變率。

 2.3  發酵試驗結果

    與空白試驗野生菌株相比，誘變菌株產酸量都有不同程度的提高。

3  結論

    通過本試驗篩選出醋酸杆菌的最佳誘變劑為：鹽酸羥胺。此試驗結果不僅可以為定向提高醋酸杆菌產酸能力提供了很有意義的理論和試驗依據，而且推動果醋的進一步發展。另外，用該誘變劑誘變後選得的高產菌株可進一步誘變或用於其他基礎研究。

參考文獻

[1]王博彥,金其黃.有機酸發酵工藝學.中國輕工業出版社,1992:392～407.

[2]盛祖嘉.微生物遺傳學（第二版）,科學出版社,1997.

[3]無錫輕工大學.微生物學（第二版）,1990,(3):64～474.

[4]陶文沂.工業微生物生理與遺傳育種學,北京：，中國輕工業出版，2000,(9):245～268 

[5]沈平.微生物學.北京:高等教育出版社,2000,(6):231～233.

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