【摘要】 目的 了解臨床分離大腸埃希菌耐環丙沙星gyrA基因突變情況。方法 用環丙沙星濃度梯度法試條檢測臨床分離大腸埃希菌最低抑菌濃度（MIC），聚合酶鏈反應(PCR)擴增gyrA基因喹諾酮耐藥決定區，擴增產物片段長度為668 bp，用限製性內切酶HinfⅠ消化PCR產物，行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果 共檢測大腸埃希菌41株，14株MIC在0.25～0.5 μg／ml的菌株，未檢出耐藥性突變位點；4株MIC在1～2 μg／ml的菌株（2株MIC為1μg／ml、1株為1.5 μg／ml，1株為2 μg／ml）均出現gyrA基因突變；耐藥菌23株（1株MIC為16 μg／ml，其餘≥32 μg／ml）也均發生gyrA基因突變。結論 臨床分離大腸埃希菌對環丙沙星耐藥性與HinfⅠ酶切位點突變密切相關，低水平耐藥菌株gyrA基因發生突變具有一定臨床意義。
A gyrA gene mutation in clinical Escherichia coli Zhang Junmin, Wu Jian, Zhao Liping, et al. Department of Microbiology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study a gyrA mutation of clinical E.coli strains.Methods We used Ciprofloxacin Etest to detect the MIC values of clinical E.coli strains, then PCR to amplify the quinolone-determining region (QRDR) of the gyrA gene, and digest the PCR products (668 bp) with HinfⅠ and 8% polyacrylamide gel electrophoresis.Results Fourty-one strains of E.coli were detected. Fourteen strains with MIC 0.25～0.5 μg/ml exhibited no gyrA mutation, but 4 strains with MIC 1～2 μg/ml and 23 strains with MIC 16～23 μg/ml gyrA gene mutation.Conclusion There was a close relationship between the clinical quinolone-resistant E.coli strains and the loss of HinfⅠ sits in gyrA gene. The gyrA gene mutation found in low-level Ciprofloxacin resistant E. coli will be useful to manage these resistant strains.
【Key words】 E.coli Ciprofloxacin gyrA gene Mutation
近年來臨床分離大腸埃希菌對喹諾酮類耐藥性的顯著上升趨勢，引起了臨床和微生物實驗室的廣泛關注。編碼DNA旋轉酶的gyrA或gyrB基因發生點突變被認為是產生耐藥性的主要原因［1］。用聚合酶鏈反應(PCR)－限製性內切酶片段長度多態性(RFLP)檢測大腸埃希菌gyrA基因突變位點，是一種簡便、易行的方法［2］。為此，我們利用此方法對臨床分離大腸埃希菌gyrA基因突變情況進行了研究，現將結果報告如下。
材料與方法
一、材料
1.菌株：臨床分離大腸埃希菌41株：23株為耐藥菌，其中1株環丙沙星最低抑菌濃度(MIC)為16 μg／ml，其餘22株MIC≥32 μg／ml；2株MIC分別為1.5 μg/ml和2 μg／ml；敏感菌16株，其中14株MIC在0.25～0.5 μg／ml，2株MIC為1μg／ml。同時也檢測大腸埃希菌ATCC 25922。
2.環丙沙星濃度梯度法試條、藥敏用培養基均為AB Biodisk產品。試條MIC結果按美國臨床試驗室標準化委員會1996年標準判斷。環丙沙星MIC≤1μg／ml為敏感，MIC≥4μg／ml為耐藥。
二、方法
1.DNA提取：按文獻［3］進行，不做RNA消化，DNA溶於0.5ml TE緩衝液中待用。
2.PCR反應擴增：喹諾酮耐藥決定區(QRDR)引物按文獻［2］，引物1為5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′，引物2為5′-CCGGTACGGTAAG-CTTCTTCAA-3′，由中國科學院微生物研究所基因工程中心合成。PCR體積25 μl：Tris-HCl 10 mmol/L，pH9.0、KCl 50 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、Triton X-100 0.1％、4×dNTPs各200 μmol/L北京寶秦克生物科技公司產品；引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1UPromega公司產品。DNA模板5 μl。93℃預變性5分鍾，93℃1分鍾、55℃1分鍾、72℃2分鍾，共40個循環。最後72℃再延伸6分鍾。1.5％瓊脂糖凝膠電泳。
3.HinfⅠ酶切分析：方法按文獻［4］進行，反應總體積20 μl：2 μl 10×反應緩衝液、10 μl PCR擴增產物、6 μl無菌水、2 μl HinfⅠ限製性內切酶（6U／μl，北京北方同正生物技術發展公司產品），8 000 r／min離心30秒，放37℃作用4小時，取10 μl消化產物行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，150V電壓1.5小時。放含0.5 μg／ml溴化乙啶的1×TBE緩衝液染色30分鍾，觀察結果並照相。
結果
用PCR方法對41株大腸埃希菌及大腸埃希菌ATCC 25922QRDR進行擴增，經1.5％瓊脂糖凝膠電泳證實，均擴增出一條片段長度為668 bp的產物。
對上述擴增產物用限製性內切酶HinfⅠ消化後行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果見附圖。電泳結果顯示環丙沙星MIC在0.25～0.5 μg／ml的大腸埃希菌及標準菌株，酶切後均為3條DNA帶，表明這些菌株的HinfⅠ酶切位點未發生突變；而2株MIC為1 μg／ml的菌株、2株中介度的菌株以及所有耐藥菌株，HinfⅠ酶切後則為2條DNA帶，表明該酶切位
1：pBR322DAN/HinfⅠ；2：大腸埃希菌ATCC 25922；MIC依次：3號0.25，4號0.5，5號1，6號1.5，7號2，8號16，9、10、11號≥32 μg/ml
附圖 大腸埃希菌QRDR擴增產物聚丙烯酰胺凝膠電泳點發生突變。
討論
喹諾酮類抗菌藥物如環丙沙星等因其抗菌譜廣等優點，在臨床得到廣泛應用。但隨著這類藥物的應用，耐藥菌也在不斷增加，其中以大腸埃希菌耐藥性增加最為顯著［3］。我們分離的大腸埃希菌對環丙沙星耐藥率從1994年的41.9％上升至1997年的60.4％。而其他腸杆菌科常見細菌如陰溝腸杆菌、產酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌等1997年耐藥率還不到12％。而從泌尿係感染病人分離的菌株，耐藥率又較非泌尿係感染病人高。從1994年的55.1％上升至1997年的73.8％。造成這一現象的原因主要與近年來喹諾酮類藥物的大量使用及不合理應用，引起抗生素介導的選擇性耐藥突變有關［5］。
大腸埃希菌對環丙沙星產生耐藥性是由染色體介導的，這包括與DNA旋轉酶（DNA gyrase）合成有關的結構基因如gyrA和gyrB，以及與細胞膜通透性或藥物排泄能力有關的調控基因發生突變，均可導致大腸埃希菌對環丙沙星產生不同程度的耐藥性［1］。Yoshida等［6］報道gyrA基因單位點突變可導致大腸埃希菌對喹諾酮類耐藥，突變發生在gyrA N末端氨基酸67～106範圍內，稱為QRDR。Fisher等［7］證實gyrA基因中密碼子83(有時可能是82)發生突變常常造成大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥，該位點的突變可用限製性內切酶HinfⅠ酶切證實。這一方法簡便易行，在研究其他細菌耐喹諾酮類gyrA基因突變中也有應用［8］。我們也是利用這一原理對大腸埃希菌gyrA基因進行突變位點檢測。
大腸埃希菌gyrA基因發生單位點突變時，僅對環丙沙星低水平耐藥，而這部分菌株一般用常規檢測MIC方法難以檢出，在抗菌藥物進一步作用下極易發展成高水平耐藥［1］。我們用濃度梯度法Etest法所測菌株中，所有耐藥菌gyrA基因均檢出突變位點。而2株敏感菌（MIC為1 μg／ml）及中介度的2株菌也出現了HinfⅠ酶切位點丟失，即gyrA該位點突變。這4例病人僅進行了一次微生物學檢查，我們無法了解這幾株菌gyrA基因突變前的藥敏變化情況，以及我們檢出gyrA基因發生突變後是否演變成了高水平耐藥。但我們的結果表明，常規藥敏方法檢測的部分敏感菌或處在中介度的菌株出現gyrA基因突變，應引起臨床及實驗室足夠重視。用常規方法檢出這部分菌株，對控製低水平耐藥大腸埃希菌發展成對環丙沙星高水平耐藥菌有一定意義。
有關低耐大腸埃希菌HinfⅠ酶切位點發生突變後，是如何演變成高耐菌還有待進一步探討。近年研究表明，其演變方式是由單位點逐步向多位點突變發展，導致DNA旋轉酶、細胞膜通透性發生變化，引起大腸埃希菌對環丙沙星高度耐藥［1］。當然並非大腸埃希菌gyrA基因發生突變就一定會引起對環丙沙星產生耐藥。Lehn等［2］研究表明包括喹諾酮類耐藥大腸埃希菌和ATCC菌株在內，gyrA&127;基因某些位點發生突變（沉默基因），由於其編碼的氨基酸序列未發生改變，並不引起大腸埃希菌對環丙沙星產生耐藥性。由此可見大腸埃希菌對環丙沙星產生耐藥性的機理非常複雜，我們僅對臨床菌株gyrA基因突變情況進行了探討，其意義在於了解臨床分離大腸埃希菌gyrA基因突變現狀，對控製大腸埃希菌耐環丙沙星有一定幫助。其他與耐藥有關的因素如菌株細胞膜通透性改變、大腸埃希菌對藥物的主動排泄，以及gyrB基因等在產生耐藥性過程中是如何相互發揮作用的，均有待進一步深入探討。
作者：張軍民 吳堅 趙莉萍 程彥國 劉梅 周貴民
單位：100853 北京，解放軍總醫院微生物科
參考文獻
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