肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性

【摘要】  目的: 評價酪蛋白裂解酶P(ClpP)作為候選疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎鏈球菌（SPN）中的表達情況. 方法: 以TIGR4型SPN的ClpP基因序列設計引物，分別以12株不同血清型SPN的基因組DNA為模板，對ClpP基因進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增、膠回收產物與PMD18克隆載體連接後進行測序，運用生物信息學方法對其核苷酸及推測的氨基酸序列及抗原性進行分析，並利用Western Blot方法檢測12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表達情況. 結果: 12株不同血清型SPN的ClpP基因序列和GenBank數據庫對已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%，推測的氨基酸序列一致性>99.5%. Western Blot結果顯示antiClpP多克隆抗體與12型SPN的菌體蛋白能夠起交叉反應. 結論: ClpP蛋白在不同型SPN之間同源性高，在不同型SPN菌株中均有表達. ClpP是一個具有前景的SPN候選蛋白疫苗因子.

【關鍵詞】  肺炎鏈球菌；ClpP基因；序列分析；抗原性

      0引言

    肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）是引起獲得性肺炎、中耳炎、鼻竇炎的主要病原菌. 隨著多重耐藥菌株的不斷發現，疫苗在預防和控製SPN感染中的作用越來越重要［1］. SPN根據莢膜可分為90多個血清型，開發對所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的發展方向. 研究發現的SPN蛋白質候選疫苗酪蛋白裂解酶P(caseinolytic protease P, ClpP）是ATP依賴的絲氨酸蛋白水解酶［2］，其在SPN的生存、致病和入血過程中起著重要的作用［3-4］，針對其靶點的疫苗或抗生素也越來越顯示出其潛在的價值. 本研究探討ClpP在不同SPN菌株中的保守性與抗原性，以及在不同血清型SPN中表達情況，旨在為自主開發SPN蛋白疫苗奠定基礎.

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1菌種與質粒12株不同血清型SPN： CMCC(B)31 109(serotype 1)，CMCC(B)31 203(serotype 3)，CMCC(B)31 446(serotype 4)，CMCC(B)31 011(serotype 5)，CMCC(B)31 207(serotype 6B)，CMCC(B)31 507(serotype 7F)，CMCC(B)31 216 (serotype 9V)，CMCC(B)31 614 (serotype 14)，CMCC(B)31 687(serotype 18C)，CMCC(B)31 693(serotype 19F)，CMCC(B)31 759(serotype 23F)（北京中國醫學細菌保藏管理中心），NCTC7466 (serotype 2，國際通用名為D39)（歐洲國家標準菌種庫）；大腸杆菌DH5a和原核表達係統(含pET32a(+)/ClpP重組質粒)E.coli BL21(DE3)(重慶醫科大學臨床檢驗診斷學重點實驗室)，金黃色葡萄球菌標準菌株(重慶醫科大學微生物學教研室)，質粒PMD18T載體試劑盒(日本TaKaRa公司).

    1.1.2試劑DNA提取試劑盒，凝膠回收試劑盒及日常型質粒DNA快速製備試劑盒(上海華舜公司)；限製性內切酶EcoRI，SacI，高保真LA Taq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大連寶生物技術公司)；丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)(美國Sigma公司)；DNA marker(上海生工公司)；Goatantimouse IgG HRP(H+L)和3二氨基苯聯胺DAB∶3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris堿(美國BBI公司)；His Bind Column(NiNTA)鎳柱(美國Novagen公司).

    1.1.3儀器熱循環儀（TMBioRad PCR，美國gene cycle公司）； 電泳儀（Power/PAC200，美國BioRad公司）.

    1.1.4動物BALB/c小鼠，雌性，8~10 wk齡，體質量18~20 g（重慶醫科大學實驗動物中心）.

    1.2方法

    1.2.1聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的基因將12株SPN在C+Y培養基中增菌至對數生長中後期，按試劑操作說明書分別提取基因組DNA，擴增ClpP的開放讀碼框架(591 bp). 上遊引物：5′CGAATTCATGATTCCTGTAGTTAT3′，含EcoRI位點；下遊引物：5′CGAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG3′，含SacI位點，引物由上海生工生物技術公司合成. 使用La Taq高保真DNA聚合酶，以不同型SPN基因組DNA為模板進行擴增. PCR體係: ddH2O 13.7 μL，5×buffer(含Mg2+) 6.0 μL，dNTP(10 mmol/L) 2.4 μL，P1(5 pmol/L) 3 μL，P2(5 pmol/L) 3 μL，SPN DNA 1.5 μL，LA Taq 0.4 μL. 在PCR儀上按下列條件進行擴增：95℃預熱5 min後反應30個周期：94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min. 末輪後72℃延伸 5 min. 取5 μL反應產物置10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定後，DNA膠回收試劑盒回收PCR產物.

    1.2.2TA克隆載體的構建與鑒定將回收純化的12個PCR產物克隆至PMD18T載體，轉入DH5α感受態細胞，在Amp+LB平板上培養得到多個陽性克隆，單個陽性克隆細菌經增菌後進行質粒抽提後雙酶切鑒定，並將質粒送往重慶醫科大學感染實驗室做雙向測序.

    1.2.3序列比對與氨基酸序列預測利用DNAssist軟件，將12個重組克隆質粒雙向測序的結果及預測的氨基酸序列與GenBank數據庫對已公布的TIGR4 SPN全基因組序列進行相似性分析.

1.2.4抗原表位預測用抗原表位預測工具ANTIGENIC PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES分析不同血清型SPN ClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.

    1.2.5PETClpP重組載體的誘導表達及純化原核表達係統pET32a(+)/ClpPE.coli BL21(DE3)在終濃度1 mmol/L IPTG，37℃，250 r/min條件下誘導目的重組蛋白ClpP的表達. 收集的菌體超聲波碎菌後，采用NiNTA柱純化目的蛋白，以SDSPAGE和BioRad凝膠圖像分析係統檢查目的重組蛋白表達與提純效果. 將透析除鹽的純化蛋白溶液經Bradford法定量後備用.

    1.2.6antiClpP抗血清的製備稀釋後重組clpP蛋白溶液與等體積的CFA或IFA充分混勻成乳狀，在小鼠腹腔下接種製備好的抗原蛋白. 初次免疫時小鼠接受含200 μL(含重組蛋白10 μg)的CFA與重組蛋白混合物；小鼠再次與末次免疫時接受200 μL(含重組蛋白10 μg)的IFA與重組蛋白混合物. 小鼠經3次免疫後，分離小鼠血清，並用ELISA法測其antiClpP抗體效價.

    1.2.7Western Blot檢測將12株SPN在C+Y培養基中增菌至對數生長中後期（A620 nm 0.5~0.6左右），各取2 mL菌液離心取沉澱. 沉澱用PBS洗3次，用1×上樣buffer處理後，於100℃水浴5 min. 全菌裂解物經SDSPAGE電泳分離後轉膜. 以antiClpP多克隆抗體為一抗（1∶400)，羊抗鼠HRPIgG為二抗（1∶5000），DAB為顯色底物，Western Blot檢測菌體中ClpP蛋白的表達，以金黃色葡萄球菌作為對照.

    2結果

    2.1目的基因PCR產物12株細菌的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後，可見清晰的擴增條帶，產量高，所有PCR產物的分子大小一致，都位於600 bp左右(圖1).

    2.2TA克隆載體的構建與鑒定將12個重組克隆質粒雙酶切後，經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，於期望位置上出現目的條帶(圖2)，證明ClpP開放讀碼框架正確克隆入PMD18T載體，同時菌落PCR結果也證明基因克隆正確.

    2.3測序結果與序列比對不同株的ClpP基因編碼區大小與TIGR4菌株中ClpP基因一樣，均為591 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼196個氨基酸，基因序列一致性超過99%. 由於遺傳密碼子的簡並性，預測的氨基酸序列一致性則為99.5%以上. 經生物學信息軟件分析結果顯示，serotype 4，5，6B 三菌株ClpP氨基酸序列與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列僅存在著一個氨基酸的差異，serotype 1 SPN與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列僅存在著兩個氨基酸的差異，其餘血清型與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列完全一致.

    2.4抗原表位分析結果12株SPN ClpP蛋白的抗原表位數目相同（分別含7個抗原表位）並且氨基酸組成及分布完全一致.

    2.5融合蛋白及其antiClpP抗體效價轉化菌經IPTG誘導後，較未誘導菌有一條明顯增粗的蛋白條帶，Mr約為42×103左右，與期望值相符合（ClpP蛋白約為Mr 21×103，再加上Mr 21×103左右的硫氧還蛋白）. 蛋白溶液經鎳離子柱親和層析後透析，SDSPAGE證明純化產物為單一蛋白，純度達90%. 該蛋白免疫小鼠後用ELISA法測得的血清效價為1∶68 000（圖3）.

    2.6ClpP蛋白的表達SPN全菌裂解物經電泳分離後，與製備的antiClpP血清反應，12型SPN全菌裂解物Mr均在21×103的位置出現特異性反應條帶，而陰性對照未見反應條帶出現(圖4). 提示不同血清型SPN中均有ClpP蛋白抗原的表達.

    3討論

    蛋白疫苗是SPN的第三代疫苗. 目前認為理想的SPN蛋白質疫苗的標準應包括:能在細胞壁表達或者以分泌方式表達、在人體內抗原性高、能誘導殺菌的抗體和具有高度的保守性. 隨著基因組學與蛋白組學的發展，SPN毒力相關蛋白候選疫苗不斷地被篩選出來. 但是一些蛋白由於等位基因的變異［5-7］，針對於該蛋白的抗體升高不能識別其等位基因變異的表達產物，從而不能誘導針對不同血清型菌株廣泛的免疫保護. 因此，候選疫苗是否具有誘導高水平、能與不同種類的型或亞型菌株起交叉反應的抗體的能力，是很多致力於SPN疫苗的專家不斷尋找高保守蛋白疫苗的原因［8-9］.

    我們要評價ClpP候選蛋白疫苗的價值就應考慮其在不同血清型SPN的保守性，並考慮ClpP是否在SPN菌體中表達. 本研究選用分離自不同標本並且在中國比較常見的［10］12株不同血清型SPN進行研究，結果發現，在12株菌中ClpP基因相當保守，其抗原表位氨基酸組成以及分布完全一致，無抗原位點的突變，而且12株SPN菌體蛋白中都有ClpP蛋白的表達. 我們的結果初步表明：ClpP在不同血清型SPN中高度保守，在不同型菌體中都有表達.

    細胞壁表達的高保守性蛋白是首選的疫苗靶點. 目前研究較多的幾個SPN蛋白質疫苗如PspA［11］，PspC［6］和PLY［12］等，PspA和PspC雖在細胞壁表達，但由於等位基因變異，保守性相對較差；PLY雖具有較高的保守性，但在細胞內表達，其抗體難以透過細胞壁與之結合，疫苗保護效果難以得到保證. 而ClpP在SPN熱休克後從細胞內向細胞壁易位［3］，同時具有高度的保守性，因此它是SPN很好的疫苗靶點，將其單獨使用或與其他的蛋白疫苗組合使用，可能會使SPN蛋白疫苗的研究取得突破性進展，從而為我們自主開發廣保護範圍的SPN疫苗提供理論基礎.

另外我們也采用了BLAST方法分析了SPN ClpP與鄰近種屬細菌ClpP基因序列的相似性，發現SPN ClpP與許多其它種屬細菌的ClpP基因序列具有高度的同源性，比如SPN的ClpP與唾液酸鏈球菌ClpP的預測氨基酸序列相似程度為87%~88%，與無乳鏈球菌ClpP的預測氨基酸序列相似程度為91%~92%. ClpP可能在這些菌屬中存在相同的抗原表位，並可能誘發交叉反應，這應該引起注意. 總之，在大規模人類免疫接種前對這類高保守蛋白進行徹底的安全性調查，將是非常必要的.

作者：李岱容，曹炬，王虹，吳凱峰，尹一兵《第四軍醫大學學報》

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