多重耐藥大腸埃希菌基因分型及其與耐藥表型的關係

【摘要】  目的 分析福州地區臨床分離的多重耐藥大腸埃希菌的基因型及其與細菌耐藥表型的關係。方法 收集臨床分離的多重耐藥大腸埃希菌88株，采用KB法進行藥敏試驗，多重PCR法進行基因分型。結果 多重PCR法可將大腸埃希菌分為4個基因型，其中檢出D型42株，B2型17株，A型17株，B1型12株。4組基因型對阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲鬆、頭孢噻肟和妥布黴素的耐藥率差別有統計學意義(P<0.05)。 結論 多重耐藥大腸埃希菌對多種抗生素具有很高的耐藥性。基因分型以致病性較強的B2型與D型為主，應采取相應措施預防院內感染。

【關鍵詞】  大腸杆菌O157;藥物耐受性; 聚合酶鏈反應;基因型;序列分析

           大腸埃希菌是醫院感染最常見的革蘭陰性條件致病菌，可在醫院環境中長期存在，尤其當患者免疫力低下時，常引起泌尿係統、下呼吸道、胃腸道、手術切口及燒傷感染和菌血症，病死率高。近年來醫院獲得性感染的發病率逐年上升，且由於抗生素的不合理應用和耐藥基因的廣泛播散，大腸埃希菌對抗生素的耐藥問題日益突出，多重耐藥臨床分離株愈發常見。筆者對臨床分離多重耐藥大腸埃希菌進行遺傳分型，以期獲得流行病學資料，便於進一步研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 菌株 收集檢驗科2008年8月-2009年2月臨床分離的多重耐藥大腸埃希菌共88株，標本來源包括痰、尿液、膽汁、創麵分泌物、血液等。多重耐藥菌定義為對任何不同三種類型以上抗生素耐藥的臨床分離株[1]。

　　1.2 儀器及試劑 常規藥敏紙片氨苄西林每片10 μg、氨苄西林/舒巴坦每片20 μg、阿米卡星每片30 μg、環丙沙星每片5 μg、左氧氟沙星每片5 μg、亞胺培南每片10 μg、複方新諾明每片25 μg、妥布黴素每片10 μg、呱拉西林/他唑巴坦每片100 μg/10 μg、頭孢唑啉每片30 μg、頭孢呋辛每片30 μg、頭孢曲鬆每片30 μg、頭孢他啶每片30 μg、頭孢噻肟每片30 μg、頭孢吡肟每片30 μg、頭孢噻肟/克拉維酸每片30 μg/10 μg、頭孢他啶/克拉維酸每片30 μg/10 μg均購自英國Oxid公司;基因分型引物、dNTP Mix(10 mmol/L)、Taq酶、瓊脂糖、Loading Buffer(6×)、Marker(100～600 bp)均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。MH瓊脂、伊紅美藍瓊脂均購自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR擴增儀(美國BIORAD公司);全自動細菌鑒定儀(VITEK60型，法國梅裏埃公司)。

　　1.3 質量控製 質控菌株為衛生部臨檢中心的大腸埃希菌ATCC 25922。

　　1.4 方法

　　1.4.1 菌株鑒定 采用全自動細菌鑒定儀鑒定菌株。

　　1.4.2 藥敏試驗 采用KB法，判斷結果參考美國臨床和實驗室標準協會CLSI標準[2]。

　　1.4.3 多重PCR 引物參照文獻[3]煮沸法提取細菌DNA作為模板進行擴增。反應體係為總體積20 μL，引物各為1 μmol/L，dNTP Mix 200 μmol/L，Taq酶2.5 U，模板2 μL。循環參數為94 ℃ 5 min→94℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共30個循環，最後1次延伸時間為7 min。引物序列及產物長度見表1。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳後觀察結果。表1 多重PCR引物序列

　　1.4.4 基因分型 根據多重PCR擴增產物的電泳結果，按照圖1進行分型[3]：

　　chuA、yjaA和TspE4.C2為多重PCR檢測的目標基因; A、B1、B2和D分別表示大腸埃希菌的四個基因型.

　　1.5 統計學處理、采用WHONE T4.0軟件分析數據。根據遺傳分型結果分為A、B1、B2、D四組，采用行列表資料的χ2檢驗對藥敏結果的數據進行分析，P<0.05為差別有統計學意義。

　2 結 果

　　2.1 多重耐藥大腸埃希菌耐藥譜分析 多重耐藥大腸埃希菌除對亞胺培南全部敏感外;對阿米卡星、呱拉西林/他唑巴坦耐藥率<14%，可作為除亞胺培南之外的臨床經驗性用藥首選;對其他常用抗生素的耐藥率均>60%;其中頭孢菌素、氟喹諾酮類耐藥率高達80%以上(表2)。　表2 多重耐藥大腸埃希菌藥敏情況

　　2.2 基因分型 采用多重PCR分析88株多重耐藥大腸埃希菌，根據PCR產物片段大小結合圖1的判讀標準進行基因分型得出結果(圖2)。本研究中的大腸埃希菌檢出D型占總數47.73%(42/88);其次為A和B2型，各占19.32%(17/88);B1型最少，占13.63%(12/88)，說明次實驗收集到的多重耐藥大腸埃希菌中，大多數存在較強的致病力。

　　2.3 不同基因分型的藥敏情況 將88株多重耐藥大腸埃希菌以不同基因型分為A、B1、B2、D 4組，並對其對15種抗生素的耐藥情況進行統計分析發現，4組對阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲鬆、頭孢噻肟和妥布黴素的耐藥率差別有統計學意義(P<0.05)。A和B2型對阿米卡星的耐藥率為0，較B1和D更為敏感;B2和D型對頭孢他啶和頭孢曲鬆的敏感性不如A和B1型;D型對頭孢噻肟最為敏感，B2對妥布黴素最敏感(表3)。表3 不同基因分型對藥物耐藥率比較

　　3 討 論

　　筆者采用文獻[3]方法對大腸埃希菌進行快速分型。該法快速、高效、準確，可在很短的時間內將大腸埃希菌分為4種主要的親緣群體，分別是A、B1、B2以及D型。Clermont等在對230株大腸埃希菌進行基因分型時發現該菌主要為B2型，其致病性最強;其次為D型的致病性稍弱;而體內共生的大腸埃希菌主要是A型[3]。本組多重耐藥大腸埃希菌中B2型占19.32%;D型檢出比例更高，占47.72%，表明在多重耐藥的大腸埃希菌中致病力較強的兩種亞型B2和D型共占67.04%，較國內文獻報道的73%略低[4]。Zhang等人報道尿路感染的大腸埃希菌中B型占69%，並推斷腸道外感染的大腸埃希菌其約2/3為B2亞型[5]，與本研究中D型占多數的比例不同，可能是標本組成不同造成差異，也可能是地區差異的緣故，因需進一步研究。研究還發現，A型感染占19.32%，與B2型占的比例相同，由於此型常見於人體內共生菌的亞型[3]，是否這些臨床分離菌屬於患者體內共生菌異位感染還有待進一步研究。

　　本組多重耐藥臨床分離菌株藥敏結果顯示，其對大部分β內酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥，而對呱拉西林/他唑巴坦和阿米卡星敏感性較高;其中對亞胺培南的敏感性為100%。盡管亞胺培南對該組細菌具有高敏感性，但因其價格昂貴，臨床上並不將其作為治療的首選用藥，因而臨床上可選用呱拉西林/他唑巴坦和阿米卡星作為經驗性用藥。結合基因分型研究與藥敏結果分析發現各種基因型藥物敏感性存在一些差異，即多重耐藥大腸埃希菌的四種基因型雖然對大多數抗生素的耐藥情況大致相同，但腸外致病較強的B2型和D型在對三代頭孢類抗生素的耐藥性均較A型和B1型強。氨基糖苷類抗生素對需氧革蘭陰性杆菌具有強大的抗菌活力，但耐藥菌株可以通過鈍化酶破壞其分子結構造成細菌耐藥。本組B2型較其他基因型對阿米卡星的敏感性較好，有待進一步探究。

通過根據基因分型結果能明確感染的病原生理學，判斷醫院感染或是感染複發[6];明確不同基因型的親緣種群與毒力的關係，提示感染致病菌來源。腸道內或腸道外的感染與不同的基因片段相關[5]，並可作為篩選致病菌的工具，作為感染暴發的篩查和流行病學調查。

作者：李彬， 黃心宏， 傅薔， 曹穎平， 潘玉紅 《福建醫科大學學報》

【參考文獻】

  1] 戴自英. 多重耐藥菌感染在臨床上的重要意義[J]. 中華傳染病雜誌, 1999,17(2);7778.

　　[2] Clinical and Laboratory Standads Institute. Performance standards for Antimicrobial susceptibility testing ;18th Informational Supplement [S] . 2008, M100S18.

　　[3] Clermont O,Bonacorsi S,Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group[J]. Appl Environ Microbiol, 2000,66(10):45554558.

　　[4] 劉 玲,鄭 鈴,陳建玲. 福州市飲食行業從業人員腸道大腸埃希菌耐藥及產ESBL狀況[J].福建醫科大學學報, 2008,42(1):6569.

　　[5] 代傑誌,陸 茜,蔡成鬆,等. 大腸埃希菌的分型研究[J]. 中國微生態學雜誌, 2008,20(5):443445.

　　[6] Zhang L X,Foxman B,Marrs C. Both urinary and rectal Escherichia coli isolates are dominated by strains of phylogenetic group B2[J]. J Clin Microbiol, 2002,40(11):39513955.

[7] 劉 丁,府偉靈. 細菌基因分型技術及其在醫院感染中的應用[J]. 中華醫院感染學雜誌, 2003,13(10):995998.

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