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詳情解釋

1範圍

第一法（色譜）適用於強化食品調製乳粉、特殊膳食用食品（不包括乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方以及氨基酸代謝障礙配方的特殊醫學用途嬰兒配方食品）和特殊用途飲料中煙酸和煙酰胺的測定。

第二法（微生物）適用於各類食品包括以天然食品為基質的強化食品食品中煙酸（或煙酰胺）的測定。

針對使用範圍進行了變更。

2原理

第一法液相色譜法原理描述變更

樣品經酶解、沉澱蛋白質等前處理後（沉澱蛋白質，高澱粉樣品經澱粉酶酶解），在弱酸性環境下超聲波振蕩提取，以C18色譜柱分離，用紫外檢測器檢測261 nm波長處檢測，根據色譜峰的保留時間定性，外標法定量，計算試樣中煙酸和煙酰胺含量。

紫外波長的數值實際操作中仍使用261nm。

3.1試劑

3.1.1鹽酸（HCl）：優級純。

3.1.2氫氧化鈉（NaOH）：優級純。

3.1.3甲醇（CH3OH）：色譜純

3.1.4異丙醇（C3H8O）：色譜純。

3.1.5庚皖磺酸鈉（C7H15NaO3S）：色譜純。

3.1.6澱粉酶：酶活力≥1.5 µ/mg。

10.1.3高氯酸（HClO4）：體積分數為60%，優級純

舊版使用高氯酸配置流動相，新版更改為鹽酸。

3.2試劑配製

3.2試劑配製

3.2.1鹽酸溶液（5.0mol/L）：量取415mL鹽酸，加水定容至1000mL。

3.2.2鹽酸溶液（0.lmol/L）：吸取8.3mL鹽酸，加水定容至1000mL。

3.2.3氫氧化鈉溶液（5.0mol/L）：稱取200g氫氧化鈉，加水定容至1000mL。

3.2.4氫氧化鈉溶液（0.1mol/L）：吸取20mL氫氧化鈉溶液（5.0mol/L），加水定容至1000mL。

10.2.5流動相：甲醇70mL、異丙醇20mL、庚烷磺酸鈉1g，用910mL水溶解並混勻後，用高氯酸調pH至2.1±0.1，經0.45µm膜過濾。

5.2液相色譜參考條件

液相色譜參考條件如下：

a）液相色譜柱：C18（粒徑5µm，250mm×4.6mm）或等效柱。

b）流動相：甲醇70mL、異丙醇20mL、庚皖磺酸鈉1g，用910mL水溶解並混勻後，用鹽酸凋節pH至2.1±0.1。

c）柱溫：25℃±0.5℃。

d）流速：1.0mL/min。

e）進樣量：20µL。

f）紫外檢測波長：261nm。

舊版使用高氯酸配置流動相，新版更改為鹽酸。

3.3標準品

3.4標準溶液配製

3.3.1煙酸（C6H5NO2，CAS號：59-67-6）：純度≥98%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準品。

3.3.2煙酰胺（C6H6N2O，CAS號：98-92-0）：純度≥98%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準品。

3.4.1煙酸和煙酰胺標準儲備溶液（1.000mg/mL）：將煙酸（或煙酰胺）標準品置入含五氧化二磷的幹燥器中，幹燥過夜。準確稱取各0.1 g（精確到1mg），用0.1mol/L鹽酸溶解，定容至100mL。2℃~8℃冷藏可保存1個月。

注：標準儲備液配製完以後，需要進行濃度校正，校正方法見附錄B。

3.4.2煙酸和煙酰胺標準混合中間液（100.0µg/mL）：準確吸取煙酸和煙酰胺標準儲備液各10.0mL於100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻。2℃~8℃冷藏可保存1個月。

3.4.3煙酸和煙酰胺標準混合工作液：分別準確吸取標準混合中間液1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL於100 mL容量脰中，加水定容至刻度，混勻，得到質量濃度分別為1.0µg/mL、2.0µg/mL、5.0µg/mL、10.0µg/mL、20.0µg/mL的標準混合工作液。臨用現配。

標準品的純度原99%，舊版無幹燥器，冷藏溫度4℃，新增冷藏保存時間。中間液舊版無保存條件，校正標準儲備液刪除。

4儀器和設備

4.1高效液相色譜儀：配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。

4.2天平：感量分別為0.1mg和0.01g。

4.3恒溫培養箱：30℃~80℃。

4.4超聲設備。

4.5 pH計：精度為0.1。

4.6粉碎機。

11.6一次性微孔濾頭：帶0.45µm微孔濾膜。

5分析步驟

5.1樣品前處理

5.1.1試樣製備

樣品預處理：取有代表性的樣品至少200g，塊狀或顆粒狀樣品用粉碎機粉碎，粉末狀、糊狀或液體樣品充分混勻，置於密閉的容器內。

5.1.2澱粉類和含澱粉的食品

5.1.2.1稱取混合均勻固體試樣約5.0g（精確到0.01g），置於150mL錐形瓶中，加入約25mL 45℃~50℃的水，加入約0.5g澱粉酶，搖勻後向錐形瓶中充氮，蓋上塞，置於50℃~60℃的培養箱內酶解約30min，取出冷卻至室溫。

5.1.2.2稱取混合均勻液體試樣約20.0g（精確到0.01g），置於150mL錐形瓶中，加入約0.5g澱粉酶，搖勻後向錐形瓶中充氮，蓋上塞，置於50℃~60℃的培養箱內酶解約30min，取出冷卻至室溫。

5.1.3不含澱粉的食品

5.1.3.1稱取混合均勻固體試樣約5.0g（精確到0.01g），置於150mL錐形瓶中，加入約25mL 45℃~50℃的水，置於超聲設備中振蕩約10min以上充分溶解，靜置5min~10min，冷卻至室溫。

5.1.3.2稱取混合均勻液體試樣約20.0g（精確到0.01g），置於150mL錐形瓶中，置於超聲設備中振蕩約10min以上，充分溶解，靜置5min~10min，冷卻至室溫。

樣品預處理標明樣品200g，並且將固體液體試樣的步驟分開，實際方式步驟上無變更。

5.1.4試樣提取

注1：必要時，試樣測定液用水進行適當的稀釋（f），使試樣測定液中煙酸和煙酰胺質量濃度在1µg/mL~20µg/mL範圍內。

注2：推薦充氮條件：壓力0.055MPa~0.062MPa氮氣充氮30s。

增加充氮條件。

6.1試樣煙酸或煙酰胺含量計算

新增加的f為5.1.4中注1的稀釋倍數。

6.2試樣煙酸和煙酰胺總含量計算

維生素PP更改為煙酸煙酰胺，同種物質。

計算結果有效位數變更。

8.其他

固體樣品：當稱樣量為5g時，煙酸檢出限為30µg/l00g，定量限為l00µg/100g，煙酰胺檢出限為40µg/l00g，定量限為120µg/l00g。

液體樣品：當稱樣量為20g時，煙酸檢出限為7.5µg/100g，定量限為25µg/100g，煙酰胺檢出限為10µg/100g，定量限為30µg/100g。

當稱樣量為5g時，煙酸檢出限為30µg/100g，定量限為100µg/100g，煙酰胺檢出限為40µg/100g，定量限為120µg/100g。

增加了樣品不同的檢出限，對應5.1步驟固體液體不同樣品處理。

9原理

煙酸和煙酰胺是植物乳植杆菌（LactiPLantibaciLLusPLantarum）生長所必需的營養素，在煙酸測定培養基中，植物乳植杆菌的生長與煙酸（或煙酰胺）的含量呈相關性，根據煙酸（或煙酰胺）含量與透光率（或吸光度）的標準曲線計算出試樣中煙酸（或煙酰胺）含量。

菌名進行變更。

10試劑和材料

除非另有規定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水或二級水。

增加可用一級水。

10.1菌株

植物乳植杆菌（LactipLantibaciLLuspLantarum）（原植物乳杆菌，LactobaciLLuspLantarum）ATCC8014或等效菌株。

10.3試劑

3.2.1鹽酸（HCl）。

10.3.1無水乙醇（C2H5OH）。

10.3.2硫酸（H2SO4）95%~98%。3.2.4濃硫酸（H2SO4）。

10.3.3氫氧化鈉（NaOH）。

10.3.4氯化鈉（NaCl）。

標定了硫酸純度要求。

10.5標準品

10.5.1煙酸（C6H5NO2，CAS號：59-67-6）：純度≥98%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準品。

10.5.2煙酰胺（C6H6N2O，CAS號：98-92-0）：純度≥98%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準品。

煙酸（C6H5NO2）：純度≥99.5%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準物質。

純度要求更改。

10.6標準溶液配製

10.6.1煙酸（或煙酰胺）標準儲備液（50µg/mL）：將煙酸（或煙酰胺）標準品置於含五氧化二磷的幹燥器中，幹燥過夜。按純度稱取，使煙酸（或煙酰胺）含量為50.0mg（精確至0.00lg），用乙醇溶液（25%）

溶解移入l000mL容量瓶，定容至刻度。

原為稱取50.0mg煙酸標準品，用乙醇溶液溶解至500mL容量瓶中，定容，新版使用1000mL的容量瓶。且沒有幹燥過夜的操作。

10.6.2煙酸（或煙酰胺）標準中間液（500ng/mL）：吸取1.0mL煙酸（或煙酰胺）標準儲備液（50µg/mL）至100mL容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容至刻度。

原為吸取1.0mL煙酸標準儲備液置於100mL棕色容量瓶中，用乙醇稀釋定容。

10.6.3煙酸（或煙酰胺）標準工作液：分兩個質量濃度，高質量濃度溶液的質量濃度為10ng/mL,低質量濃度溶液的質量濃度為5ng/mL。從中間液中（500ng/mL）吸取2次，各2mL，分別移入l00mL和200mL容量瓶，用水定容至刻度。

注：配製標準溶液使用棕色容量瓶，配製後的標準溶液要用棕色試劑瓶2℃~8℃冷藏於冰箱內。標準儲備液和中間液保存期6個月，標準使用液臨用現配。

稱量和容器變更，新版新增標準溶液儲存時間和條件要求。

11儀器和設備

11.1分析天平：感量為0.1mg和0.01g。

11.2離心機。

11.3渦旋混合器。

11.4pH計：精度為0.01

11.5恒溫培養箱：36℃±1℃。

11.6分光光度計：540nm~60nm。

11.7酶標儀：540nm~660nm。

11.8冰箱：2℃~8℃。

11.9無菌微孔板。

11.10定量濾紙：直徑90mm。

11.11試管：18mm*180mm。

11.12容量瓶：容量100mL、200mL、250mL、500mL。

11.13單刻度移液管：1mL、5mL、10mL。

11.14刻度吸管：5mL（具0.1mL刻度）。

11.15玻璃漏鬥：直徑100mm。

11.16錐形瓶：容量250mL。

11.17燒杯：容量100mL。

11.18分液器：0mL~10mL。

11.19微量移液器：1000µL，200µL。

11.20無菌離心管：1.5mL。

11.21針頭過濾器：孔徑0.22µm。

注：清洗後的玻璃器皿和金屬器具在250℃下幹熱1h~2h。

刪除：均質設備、壓力蒸汽消毒器、超淨工作台、超聲波振蕩器。

12分析步驟

12.1測試菌懸液製備

12.1.1將植物乳植杆菌菌株活化後，用接種針穿刺接種到乳酸杆菌瓊脂培養基上，36℃±1℃培養16h~24h，再轉種2代~3代以增強活力。以斜麵培養物方式置冰箱冷藏，可保存1個月。

12.1.2將24h內活化後的菌株轉種至已滅菌的乳酸杆菌肉湯中，36℃±1℃培養16h~4h。以3000r/min~5000r/min離心5 min，棄去上清液，加入10mL生理鹽水，用渦旋混合器振蕩該懸液，再離心約5min，棄去上清液。如前操作清洗2次~3次後，再加10mL生理鹽水，振蕩混勻。吸取適量該菌懸液於10mL生理鹽水中，混勻製成測試菌懸液。

12.1.3以生理鹽水做空白，用分光光度計於550nm波長下測定測試菌懸液透光率（%T），調整上述菌液加入量，使測試菌懸液透光率在60%T~80%T。

原為取出後放入2℃~4℃冰箱中保存。每月至少傳種一次，作為儲備菌株保存。

新規定離心機的轉速。

原使用721分光光度計。

12.2試樣提取

塊狀、顆粒狀試樣需粉碎；乳粉、米粉等粉狀試樣需混勻；果蔬、肉、蛋、魚、動物內髒等需製成食糜；半固體食品等試樣需勻漿混勻；液體試樣用前振搖混合。

12.2.1固態試樣：準確稱取（精確至0.001g）試樣於錐形瓶中，其中新鮮果蔬試樣2g~5g；穀類、豆類、堅果類、內髒、生肉、幹製試樣0.2g~1g；乳粉、米粉等試樣2g~3g；一般營養素補充劑、複合營養強化劑0.1g~0.5g；其他食品0.2g~1g。

12.2.2液體飲料或流質、半流質試樣：稱取5g~10g（精確至0.001g）（或用單刻度移液管吸取適量體積）於錐形瓶中。特殊用途飲料稱取樣品後不需按12.2.3進行處理，稱樣後直接定容至100mL（V）後，按12.2.4進行稀釋。

如果試樣煙酸（或煙酰胺）含量過低，可適當提高稱樣量。

12.2.3加入試樣質量（以克計）10倍的硫酸溶液B（以毫升計），將上述混合物放入壓力蒸汽滅菌器，121℃下水解30min，取出迅速水浴冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液A和氫氧化鈉溶液B調節pH至4.5±0.2，移入250mL（V1）容量瓶中，用水定容至刻度。

用定量濾紙過濾，最初約10mL濾液應棄去，吸取5mL（V2）濾液於100mL燒杯中，加水約20mL，用氫氧化鈉溶液B調節pH至6.8±0.2，移入100mL（V）容量瓶中加水定容至刻度。

12.2.4稀釋：根據試樣中煙酸（或煙酰胺）含量用水對提取液進行適當稀釋，使稀釋後試樣提取液中煙或煙酰胺）質量濃度為5ng/mL~12ng/mL。

固態和液體試樣重新劃分稱樣方式。

原來用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調pH至6.0~6.5，再用0.1mol/L鹽酸調pH至4.5±0.1，現在是用不同濃度的氫氧化鈉AB調到4.5±0.2。

12.3.1試管培養法

12.3.1.1標準曲線係列管

按表l順序加入水、標準曲線工作液和煙酸測定用培養基至培養試管中，表l中每一編號需製作3管。未接種空白試管（UN）、接種空白試管（IN）、標準係列管S1~S8中煙酸（或煙酰胺）質量濃度分別為0ng、0ng、5ng/mL、l0ng/mL、l5ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。

標準曲線的濃度範圍變小，提高測量精密度。

12.3.1.3滅菌

將標準曲線係列管和試樣係列管放入壓力蒸汽滅菌器，121℃下滅菌5min（商品培養基按標簽說明進行滅菌），取出後迅速用水浴冷卻到室溫。為了保證加熱和冷卻過程中溫度均勻，滅菌試管不應距離滅菌器內壁過近，試管擺放不應過密，以免影響空氣流通。

新版增加冷卻到室溫，強調了空氣流通。

12.3.1.4接種

在無菌條件下，向上述每管中（標準曲線未接種空白管UN除外）各加入l滴（50µL~100µL）測試菌液，加蓋，充分振蕩混勻所有培養管。

明確滴加一滴的範圍。

12.3.1.5培養

將試管放入恒溫培養箱內，36℃土1℃下培養18h~24h。培養至濁度不變化。

12.3.1.6測定

新增空白對照要目視澄清。

進行兩次空白測試。

新標準裏試樣超過標準曲線S1-S8範圍的要舍去。

結果篩選要求更改。

12.3.2微孔板培養法

新增條目方法

12.3.2.1標準曲線係列離心管

將煙酸標準曲線工作液在無菌條件下過濾除菌至無菌離心管中，按表3製備3套標準曲線係列離心管。未接種空白孔（UN）、接種空白孔（IN）、S1~S8中煙酸（或煙酰胺）質量濃度與試管法相同。

新方法的標準曲線跟試管法的配製方法類似，區別於工作液增加量不同。

12.3.2.2試樣係列離心管

將稀釋後的試樣提取液（12.2.4）無菌條件下過濾除菌，按表4製備3套試樣係列離心管。

12.3.2.3接種和培養

煙酸測定培養基滅菌冷卻後（或者尤菌條件下過濾除菌），每10 mL培養基中加入測試菌懸液（12.1.3）100µL~200µL，混勻，吸取150µL加入微孔板中。UN（未接種空白）使用未加入菌懸液的培養基。從標準曲線係列離心管和試樣係列離心管吸取150µL加入微孔板中，覆膜，置於恒溫培養箱中，36℃±1℃下培養18h~24h。

需留出空白對照UN。

12.3.2.4測定

培養結束後，對每個孔進行目測檢查，未接種空白孔（UN）內培養液應是澄清的，否則測定無效。標準曲線孔和試樣孔中培養液的吸光度應有梯度差別。將微孔板置於酶標儀內，540nm~550nm（或者610nm~630nm）選擇穩定波長進行比色。

記錄比色後的吸光度，數據處理同試管培養法12.3.1.6.2和12.3.1.6.3。計算全部編號試樣孔的總平均值為p，按式（3）根據稀釋倍數和稱樣量計算出試樣中煙酸（或煙酰胺）的含量。

注：也可使用與本標準檢測原理相同且經等效驗證的煙酸和煙酰胺檢測試劑盒。

數據處理與試管法相同。

13分析結果的表述

試樣中煙酸（或煙酰胺）含量按式（3）計算。

計算結果保留3位有效數字

注1：對於特殊用途飲料等不經處理直接定容的樣品，式中去除Vl和V2。

注2：如果用煙酸標準品配製標準溶液，測定結果則以煙酸計；如果用煙酰胺標準品配製標準溶液，測定結果以煙酰胺計。

注3：煙酰胺的結果乘以換算係數1.008，可以轉化為煙酸的結果。

注4：如果樣品中煙酸（或煙酰胺）含量較高，可適當進一步稀釋；如果含量較低，可適當提高樣品稱樣量或降低稀釋倍數。

新增結果有效數字要求，煙酸煙酰胺換算係數。

14精密度

在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。

普通食品在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%;

強化食品在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的5%。

精密度合並

15其他

15.1需要提取的樣品：當稱樣量為2g本標準定量限為1250µg/100g。

15.2特殊用途飲料等不經12.2.3步驟處理直接定容的樣品：當稱樣量為10g時定量限為5µg/100g。

重新更改定量限，並新增特殊用途飲料的定量限。

培養基

版本

成分變更

配製方法變更

HB8636

乳酸杆菌瓊脂培養基

新版

腖化乳15.0g

酵母浸膏5.0g

葡萄糖10.0g

番茄汁100mL

磷酸二氫鉀2.0g

聚山梨糖單油酸酣1.0g

瓊脂10.0g

蒸溜水1000mL

番茄汁的製備：將新鮮的西紅柿洗淨後稱重切碎，加等量的蒸溜水在100℃水浴中加熱，攪拌90min，然後用紗布過濾，校正pH為7.0±0.1，將浸出液分裝後，121℃下高壓滅菌15min。

將各成分加入蒸溜水中，加熱溶解，攪拌的同時保持煮沸狀態2min~3min，凋節pH至6.8±0.2（20℃~25℃），混合均勻後分裝試管，每管10mL。121℃下高壓滅菌15min。

舊版

光解腖15g

葡萄糖10g

磷酸氫二鉀2g

聚山梨糖單油酸酯1g

番茄汁100mL

瓊脂10g

蒸餾水1000mL

先將除瓊脂以外的其他成分溶解於蒸餾水中，調節pH6.8±0.2（20℃~25℃），再加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂融化。

混合均勻後分裝試管，每管10mL。121℃高壓滅菌15min，備用。

HB8637

乳酸杆菌肉湯培養基

新版

腖化乳15.0g

酵母浸膏5.0g

葡萄糖10.0g

番茄汁100mL

磷酸二氫鉀2.0g

聚山梨糖單油酸酯1.0g

蒸溜水1000mL

將各成分加入蒸溜水中，加熱溶解，攪拌的同時保持煮沸狀態2min~3min，凋節pH至6.8±0.2（20℃~25℃），混合均勻後分裝試管，每管10mL。121℃下高壓滅菌15min。

舊版

光解腖15g

葡萄糖10g

磷酸氫二鉀2g

聚山梨糖單油酸酯1g

番茄汁100mL

蒸餾水1000mL

將上述成分溶解於水中，調節pH6.8±0.2（20℃~25℃），

分裝10mL於試管中，121℃高壓滅菌15min，備用。

HB7019-2

煙酸（或煙酰胺）測定用培養基

新版

去維生素水解酪蛋白12.0g

酪蛋白氨基酸12g

葡萄糖40.0g

乙酸鈉20.0g

L-胱氨酸0.4g

DL-色氨酸0.2g

鹽酸腺膘呤20.0mg

鹽酸鳥膘呤20.0mg

尿嘧啶20.0mg

鹽酸硫胺素200.0µg

泛酸鈣200.0µg

鹽酸吡哆醇400.0µg

核黃素400.0µg

對氨基苯甲酸200.0µg

p-氨基苯甲酸100µg

生物素0.8µg

磷酸氫二鉀1.0g

磷酸二氫鉀1.0g

硫酸鎂0.4g

氯化鈉20.0mg

硫酸亞鐵20.0mg

硫酸猛20.0mg

蒸溜水1000mL

將上述成分溶解於水中，加熱溶解，攪拌的同時保持煮沸狀態2 min~3 min，凋節pH至6.8±0.2（20℃~25℃），備用。

舊版

將上述成分溶解於水中，調pH至6.7±0.2（20℃~25℃），備用。

序號

新標準（2023版）

舊標準（2016版）

名稱

貨號

名稱

貨號

1

乳酸杆菌瓊脂培養基

HB8636

一致

一致

2

乳酸杆菌肉湯培養基

HB8637

一致

一致

3

煙酸（或煙酰胺）測定用培養基

HB7019-2

煙酸測定用培養基

HB7019-1